Base and prime editing tools as correction approaches for rare genetic diseases

Background and aims Recent advancements in genome editing have introduced Base Editing (BE) and Prime Editing (PE) as transformative tools for precise genetic modifications without inducing double-strand DNA breaks. BE utilizes a catalytically impaired Cas enzyme fused to a single-stranded DNA deaminase, enabling targeted nucleotide conversions. The two main classes, Cytosine Base Editors (CBEs) and Adenine Base Editors (ABEs), facilitate C•G-to-T•A and A•T-to-G•C transitions, respectively, covering approximately 61% of pathogenic single-nucleotide variants (SNVs) in the ClinVar database. In contrast, PE expands editing capabilities by incorporating a reverse transcriptase guided by a prime editing RNA (pegRNA), enabling targeted small insertions, deletions, and all 12 possible base-to-base conversions. With the ability to correct an estimated 89% of human genetic diseases, PE offers broader versatility compared to BE. This PhD project explores the therapeutic potential of BE and PE for correcting pathogenic mutations associated with Fabry Disease (FD), Rett Syndrome (RTT), and Hemophilia A (HA), evaluating their efficacy and precision in relevant disease models. Results FD- Transient analysis using the GLA-Luciferase system and Western blotting identified the most effective BE and PE systems for each variant. The highest functional rescue was observed for the p.R342* mutation, with luciferase activity reaching up to 40% of wild-type levels and full-length protein restoration confirmed by Western blot. RTT- Transient assays identified optimal BE and PE systems, with EGFP expression increasing by 35–40% for each variant. In stable clones, PE-mediated correction efficiently restored MeCP2 expression up to 60% of wild-type levels, as confirmed by FACS, Western blotting, and microscopy analysis. DNA-level assessment by ddPCR validated the correction, though rescue levels appeared underestimated. PE delivery using a dual AAV split system in p.R294* patient-derived fibroblasts demonstrated increasing correction over time (~74% WT at t1 to 100% WT at t2), suggesting a positive selection for MeCP2-expressing clones. Immunohistochemistry confirmed the synthesis and nuclear localization of the full-length MeCP2 protein. HA- Transient expression studies identified the p.R2166* and p.R2228Q mutations as the most responsive to BE/PE, with FVIII expression increasing up to 25% of wild-type levels. In stable clones, ABE8e delivered via lentiviral vectors successfully rescued the p.R602C mutation, restoring FVIII expression up to 90% of wild-type levels at both antigen and activity levels. BE treatment of p.R2166* and p.R2228Q variants resulted in ~24% DNA correction, consistent with FVIII secretion and activity improvements of 20–30%. Further, lentiviral-mediated BE delivery in engineered blood outgrowth endothelial cells (BOECs) carrying p.R2166* and p.R2228Q mutations led to a dose-dependent increase in functional FVIII secretion. Conclusions Overall data clearly demonstrated the BE/PE ability in precisely correct selected mutations at DNA level, thus efficiently restoring expression of a functional protein. The degree of correction was influenced by mutation type, genomic context, and the specific guide and editor combinations used. This proof-of-concept study highlights the potential of BE and PE as mutation-specific, targeted genome-editing strategies for monogenic disorders, paving the way for future therapeutic applications.

Introduzione e scopo Il Base e Prime Editing (BE e PE) sono nuovi approcci di Genome Editing che permettono di modificare il genoma in maniera precisa senza introdurre rotture nella doppia elica di DNA. I base editors sono costituiti da un enzima Cas (“nickasi”) fuso con una deaminasi, e permettono di modificare il nucleotide bersaglio. Sono state sviluppate due classi principali di base editors, CBE (Cytosine Base Editor) e ABE (Adenine Base Editor). Questi editors permettono l’installazione delle quattro possibili transizioni, che rappresentano circa il 61% dei polimorfismi a singolo nucleotide umani patogeni nel database ClinVar. Il PE, guidato da un pegRNA, comprende una fase di trascrizione inversa per l’introduzione della modifica desiderata e permette di eseguire piccole inserzioni, delezioni e le 12 possibili conversioni tra basi. Questo approccio consente potenzialmente la correzione del 89% delle malattie genetiche umane. Questo progetto di dottorato ha lo scopo di studiare il potenziale terapeutico del BE e del PE per revertire mutazioni patogene associate a malattie genetiche, utilizzando come modelli di studio la malattia di Fabry (FD), la sindrome di Rett (RTT) e l’emofilia A (HA). Risultati FD- L’analisi in transiente utilizzando un sistema reporter (GLA-Luciferasi) e il Western Blot hanno permesso di identificare le combinazioni di BE/PE migliori per ogni mutazione selezionata, mostrando la migliore attività di luciferasi per la mutazione p.R342* (fino al 40% rispetto al WT) e il ripristino della proteina intera. RTT- L’analisi in transiente ha permesso di identificare le migliori combinazioni di BE/PE, mostrando un aumento dell’espressione della EGFP di circa il 35-40% per ogni mutazione selezionata. Nei cloni stabili, il PE ha ripristinato in modo efficace l’espressione di MeCP2 (fino al 60% rispetto al WT), analizzando i livelli proteici mediante FACS, Western Blot e analisi al microscopio. Studi a livello di DNA (mediante ddPCR) hanno evidenziato la correzione delle diverse mutazioni. Il PE è stato utilizzato per correggere la mutazione p.R294* in fibroblasti di paziente eterozigote, ed è stato veicolato utilizzando due AAV. L’analisi a livello di DNA ha mostrato la correzione della mutazione, con l’aumento dei livelli della correzione nel corso del tempo (~74%WT al t1 e 100%WT al t2). Studi di immunoistochimica hanno confermato la produzione della proteina corretta, localizzata nel nucleo. HA-Sono state eseguite analisi in transiente per identificare le combinazioni di BE/PE più efficaci. Le mutazioni p.R2166* e p.R2228Q hanno mostrato un maggiore aumento di espressione di FVIII (fino al 25% del WT). Studi nei cloni stabili hanno dimostrato la correzione della mutazione p.R602C utilizzando ABE8e (veicolato mediante vettori lentivirali), mostrando livelli di antigene e proteina corrispondenti al 90% rispetto al WT. Inoltre, il BE è stato utilizzato per revertire le varianti p.R2166* e p.R2228Q, evidenziando una correzione a livello del DNA di circa il 24%, comparabile ai livelli di secrezione e attività osservati (dal 20% al 30%). Il sistema di veicolazione lentivirale per il BE è stato utilizzato per bersagliare le mutazioni p.R2166* e p.R2228Q in cellule endoteliali derivate da pazienti emofilici ingegnerizzate, e ha mostrato un ripristino della secrezione della proteina intera in maniera dose-dipendente. Conclusioni Complessivamente i dati ottenuti hanno dimostrato che gli approcci BE/PE sono stati in grado di bersagliare e correggere le mutazioni selezionate, ripristinando l’espressione della proteina con un’efficienza diversa a seconda del tipo e della posizione della mutazione, e delle combinazioni di molecole guida/editor utilizzati. Questi risultati sono una prova della versatilità, dell’efficacia di questi sistemi ed evidenziano il loro potenziale per il trattamento personalizzato di malattie monogeniche.