PRIN 2005 Coordinatore Nazionale del progetto Prof. Francesco Caciagli- Responsabile dell'Unità di Ferrara Dott. Stefania Gessi. Deorfanizzazione di nuovi recettori purinici accoppiati a proteine G: caratterizzazione farmacologica e biochimica in sistemi di espressione eterologhi e in cellule native.

Gli obiettivi principali di questa unità sono: 1) caratterizzazione farmacologica e biochimica del nuovo recettore per la guanosina e l’adenina in sistemi di espressione eterologhi e in cellule native per mezzo di esperimenti di “binding” del GTPS e di misurazioni dei livelli del calcio e dell’IP3 intracellulari. In dettaglio il progetto di ricerca sarà sudiviso nelle seguenti fasi: A) Una parte del progetto sarà finalizzata a studiare l’interazione ligando/recettore del nuovo recettore della guanosina per mezzo di studi del “binding” della [3H]-guanosina. Questi esperimenti saranno utili per valutare l’espressione in termini di affinità e densità recettoriali del nuovo recettore della guanosina in sistemi ricombinanti forniti dall’Unità di Chieti. Durante il secondo anno di attività gli studi di “binding” saranno effettuati in tessuti nativi che esprimono i recettori della guanosina eventualmente eventualmente sia in assenza che in presenza di piccoli RNA interferenti per l’inattivazione genica specifica. B) Un altra parte dello studio sarà rivolta a correlare i dati di “binding” con alcuni rilevanti eventi post-recettoriali. L’attivazione dei GPCR verrà determinata valutando la capacità di agonisti (nel nostro caso adenina e guanosina e altri interessanti potenziali ligandi) di stimolare il “binding” della [35S]-guanosina-5’-O-(3-tio)trifosfato ([35S]GTPS) in membrane ottenute da cellule sovraesprimenti i recettori. Eventualmente durante il secondo anno di attività, analoghi esperimenti saranno effettuati su tessuti nativi esprimenti i recettori endogeni come suggerito dagli studi di RT-PCR effettuati dalle unità di Chieti e Camerino, sia in assenza che in presenza di piccoli RNA interferenti per ottenere il silenziamento genico in vivo e ridurre in modo significativo l’espressione funzionale dei nuovi recettori clonati. C) Per quanto riguarda i sistemi effettori, è molto probabile che tutti i recettori orfani utilizzino almeno uno di questi secondi messaggeri, l’adenilato ciclasi o il calcio intracellulare. Il primo sistema verrà investigato dall’Unità di Chieti, mentre per quanto riguarda la valutazione del calcio, misurazioni dirette di questo importante ione saranno effettuate dalla nostra unità in cellule trasfettate con i recettori della guanosina e dell’ adenina, usando l’indicatore fluorescente FURA 2/AM.