L’ emicrania è una delle condizioni neurologiche più diffuse a livello globale e ha un impatto significativo sulla salute pubblica e sulla qualità della vita. La sua fisiopatologia è complessa e multifattoriale, e i trattamenti attuali, che spaziano dagli analgesici classici alle terapie più recenti dirette al peptide correlato al gene della calcitonina (CGRP), risultano ancora insufficienti per molti pazienti. Limiti quali efficacia inadeguata, effetti avversi o scarsa aderenza terapeutica evidenziano la necessità di nuove strategie farmacologiche. Tra i candidati emergenti, il sistema Nocicettina/Orfanina FQ (N/OFQ)–recettore NOP ha attirato crescente attenzione, poiché diversi studi lo hanno collegato a meccanismi rilevanti per l’emicrania. Questa tesi si è proposta di valutare il recettore NOP come potenziale bersaglio per terapie antiemicraniche e di sviluppare e caratterizzare nuovi agonisti NOP come possibili farmaci innovativi. Il lavoro sperimentale ha coinvolto topi CD-1 wild-type (NOP+/+) e topi knockout per il recettore NOP (NOP−/−), sia maschi che femmine. Il dolore correlato all’emicrania è stato modellato utilizzando due approcci complementari: la somministrazione di CGRP, in grado di indurre allodinia meccanica periorbitale (PMA), e lo stress da contenzione ripetuto, noto per evocare PMA e sensibilizzare gli animali a una dose sottosoglia di nitroglicerina (GTN). Per valutare il potenziale terapeutico dell’attivazione del recettore NOP, sono stati testati due agonisti: AT-403, un composto in grado di attraversare la barriera ematoencefalica, e UFP-112, un peptide ad azione periferica. Studi cellulari aggiuntivi hanno analizzato la capacità di N/OFQ di modulare la segnalazione a livello della membrana plasmatica e degli endosomi in cellule HEK293 esprimenti NOP, e di contrastare l’aumento di cAMP indotto da CGRP nelle cellule di Schwann umane. Infine, nuovi derivati di N/OFQ sono stati sintetizzati tramite strategie di dimerizzazione e valutati attraverso diversi saggi in vitro e tramite il test della perdita del riflesso di raddrizzamento (RR) in vivo. L’allodinia indotta da CGRP è risultata simile nei topi NOP+/+ e NOP−/−, e entrambi i genotipi hanno mostrato sensibilità comparabile allo stress e alla sensibilizzazione al GTN, suggerendo che il sistema NOP endogeno non moduli la nocicezione correlata all’emicrania in condizioni basali. Tuttavia, l’attivazione esogena del recettore NOP si è rivelata altamente efficace: sia AT-403 sia UFP-112 hanno ridotto significativamente la PMA evocata dal CGRP e prevenuto l’allodinia indotta da GTN negli animali stressati. In particolare, l’agonista periferico UFP-112 si è dimostrato efficace quanto AT-403, indicando un ruolo predominante dei recettori NOP periferici negli effetti antiemicranici. Gli studi cellulari hanno mostrato che l’attivazione di NOP induce l’internalizzazione del recettore verso gli endosomi precoci, il reclutamento di Gαi sia in membrana sia negli endosomi, e la riduzione dell’aumento di cAMP mediato da CGRP. Tutti i derivati dimerici di N/OFQ hanno agito come agonisti completi del recettore NOP; il più potente, il composto 1h, ha mostrato attività subnanomolare, una potenza tripla rispetto a N/OFQ in vivo e una durata d’azione prolungata. Nel complesso, questi risultati supportano gli agonisti NOP, soprattutto quelli ad azione periferica, come promettenti candidati per il trattamento dell’emicrania. Il composto 1h emerge come un potenziale capofila potente e a lunga durata. Ulteriori studi sono necessari per chiarire l’interazione meccanicistica tra i sistemi NOP e CGRP, che potrebbe rappresentare una nuova strategia terapeutica.
Migraine is one of the most widespread neurological conditions globally and significantly impacts public health and quality of life. Its pathophysiology is complex and multifactorial, and current treatments, ranging from classical analgesics to more recent therapies targeting calcitonin gene-related peptide (CGRP), remain insufficient for many patients. Limitations such as inadequate efficacy, adverse effects, or poor adherence highlight the need for novel therapeutic strategies. Among emerging candidates, the Nociceptin/Orphanin FQ (N/OFQ)–NOP receptor system has gained increasing attention, as several studies have implicated it in mechanisms relevant to migraine. This thesis aimed to evaluate the NOP receptor as a potential target for anti-migraine therapy and to develop and characterize new NOP agonists as innovative drug candidates. The experimental work involved male and female CD-1 wild-type mice (NOP+/+), and NOP receptor knockout mice (NOP−/−). Migraine-related pain was modeled using two complementary approaches: administration of CGRP, which induces periorbital mechanical allodynia (PMA), and repeated restraint stress, known to provoke PMA and sensitize animals to a subthreshold dose of nitroglycerin (GTN). To assess the therapeutic potential of NOP receptor activation, two agonists were tested: AT-403, a brain-penetrant compound, and UFP-112, a peripherally restricted peptide. Additional cellular studies examined whether N/OFQ could modulate signaling at the plasma membrane and endosomal levels in HEK293 cells expressing NOP, and whether it could counteract CGRP-induced cAMP increases in human Schwann cells. Finally, novel N/OFQ derivatives were synthesized via dimerization and evaluated through multiple in vitro assays and an in vivo loss of righting reflex (RR) test. CGRP-induced allodynia was similar in NOP+/+ and NOP−/− mice, and both genotypes showed comparable susceptibility to stress and GTN sensitization, suggesting that endogenous NOP receptor signaling does not modulate migraine-related nociception under baseline conditions. Nonetheless, exogenous activation of NOP receptors proved robustly effective: both AT-403 and UFP-112 significantly reduced CGRP-evoked PMA and prevented GTN-induced allodynia in stressed animals. Notably, the peripheral agonist UFP-112 was as effective as the brain-penetrant AT-403, indicating that peripheral NOP receptors play a major role in mediating anti-migraine effects. Cellular studies revealed that NOP activation triggered receptor internalization into early endosomes, recruited Gαi both at the membrane and in endosomes, and attenuated CGRP-stimulated cAMP production in Schwann cells. All dimeric N/OFQ derivatives acted as full NOP agonists; the most potent, compound 1h, showed subnanomolar activity, threefold higher in vivo potency than N/OFQ, and a prolonged duration of action. Overall, the findings support NOP agonists, especially peripherally restricted agents, as promising candidates for migraine treatment. Compound 1h stands out as a particularly potent, long-acting lead molecule. Further research is needed to clarify the mechanistic interaction between NOP and CGRP pathways, which may represent a novel therapeutic avenue.
Investigation of the NOP receptor as a novel therapeutic target for migraine
POLA, PIETRO
2026
Abstract
L’ emicrania è una delle condizioni neurologiche più diffuse a livello globale e ha un impatto significativo sulla salute pubblica e sulla qualità della vita. La sua fisiopatologia è complessa e multifattoriale, e i trattamenti attuali, che spaziano dagli analgesici classici alle terapie più recenti dirette al peptide correlato al gene della calcitonina (CGRP), risultano ancora insufficienti per molti pazienti. Limiti quali efficacia inadeguata, effetti avversi o scarsa aderenza terapeutica evidenziano la necessità di nuove strategie farmacologiche. Tra i candidati emergenti, il sistema Nocicettina/Orfanina FQ (N/OFQ)–recettore NOP ha attirato crescente attenzione, poiché diversi studi lo hanno collegato a meccanismi rilevanti per l’emicrania. Questa tesi si è proposta di valutare il recettore NOP come potenziale bersaglio per terapie antiemicraniche e di sviluppare e caratterizzare nuovi agonisti NOP come possibili farmaci innovativi. Il lavoro sperimentale ha coinvolto topi CD-1 wild-type (NOP+/+) e topi knockout per il recettore NOP (NOP−/−), sia maschi che femmine. Il dolore correlato all’emicrania è stato modellato utilizzando due approcci complementari: la somministrazione di CGRP, in grado di indurre allodinia meccanica periorbitale (PMA), e lo stress da contenzione ripetuto, noto per evocare PMA e sensibilizzare gli animali a una dose sottosoglia di nitroglicerina (GTN). Per valutare il potenziale terapeutico dell’attivazione del recettore NOP, sono stati testati due agonisti: AT-403, un composto in grado di attraversare la barriera ematoencefalica, e UFP-112, un peptide ad azione periferica. Studi cellulari aggiuntivi hanno analizzato la capacità di N/OFQ di modulare la segnalazione a livello della membrana plasmatica e degli endosomi in cellule HEK293 esprimenti NOP, e di contrastare l’aumento di cAMP indotto da CGRP nelle cellule di Schwann umane. Infine, nuovi derivati di N/OFQ sono stati sintetizzati tramite strategie di dimerizzazione e valutati attraverso diversi saggi in vitro e tramite il test della perdita del riflesso di raddrizzamento (RR) in vivo. L’allodinia indotta da CGRP è risultata simile nei topi NOP+/+ e NOP−/−, e entrambi i genotipi hanno mostrato sensibilità comparabile allo stress e alla sensibilizzazione al GTN, suggerendo che il sistema NOP endogeno non moduli la nocicezione correlata all’emicrania in condizioni basali. Tuttavia, l’attivazione esogena del recettore NOP si è rivelata altamente efficace: sia AT-403 sia UFP-112 hanno ridotto significativamente la PMA evocata dal CGRP e prevenuto l’allodinia indotta da GTN negli animali stressati. In particolare, l’agonista periferico UFP-112 si è dimostrato efficace quanto AT-403, indicando un ruolo predominante dei recettori NOP periferici negli effetti antiemicranici. Gli studi cellulari hanno mostrato che l’attivazione di NOP induce l’internalizzazione del recettore verso gli endosomi precoci, il reclutamento di Gαi sia in membrana sia negli endosomi, e la riduzione dell’aumento di cAMP mediato da CGRP. Tutti i derivati dimerici di N/OFQ hanno agito come agonisti completi del recettore NOP; il più potente, il composto 1h, ha mostrato attività subnanomolare, una potenza tripla rispetto a N/OFQ in vivo e una durata d’azione prolungata. Nel complesso, questi risultati supportano gli agonisti NOP, soprattutto quelli ad azione periferica, come promettenti candidati per il trattamento dell’emicrania. Il composto 1h emerge come un potenziale capofila potente e a lunga durata. Ulteriori studi sono necessari per chiarire l’interazione meccanicistica tra i sistemi NOP e CGRP, che potrebbe rappresentare una nuova strategia terapeutica.I documenti in SFERA sono protetti da copyright e tutti i diritti sono riservati, salvo diversa indicazione.
