Synthesis and biological evaluation of proteasome modulators for treatment of cancer and neurodegenerative diseases

Il sistema ubiquitina–proteasoma rappresenta un meccanismo essenziale per la degradazione intracellulare delle proteine e svolge un ruolo centrale nel mantenimento dell’omeostasi cellulare. Articolato in due fasi principali, esso garantisce l’equilibrio proteico attraverso il riconoscimento, la digestione e l’eliminazione di proteine mal ripiegate o mutate. Il processo proteolitico mediato dal proteasoma costituisce un bersaglio farmacologico di grande rilevanza, poiché la sua disfunzione è stata associata a numerose patologie. In particolare, alterazioni dell’attività proteasomiale sono state correlate a neoplasie, come la leucemia mieloide acuta, caratterizzata da iperattività del proteasoma, e a malattie neurodegenerative quali Alzheimer, Parkinson e demenze, accomunate da uno squilibrio della proteostasi e dall’accumulo di proteine tossiche. L’inibizione o l’attivazione del proteasoma rappresentano pertanto strategie terapeutiche di interesse per ristabilire l'omeostasi cellulare. Sebbene l’inibizione del proteasoma sia già sfruttata clinicamente, molti farmaci, spesso di natura peptidica, presentano limiti dovuti a rapido metabolismo, potenziale immunogenicità ed effetti avversi significativi. Di conseguenza, la ricerca mira allo sviluppo di nuovi inibitori dotati di migliore sicurezza ed efficacia. Al contrario, la modulazione positiva del proteasoma è un approccio più recente: diversi attivatori sono stati identificati mediante screening ad alta processività, ma i loro meccanismi d’azione restano in gran parte da chiarire. Questa tesi di dottorato è dedicata alla sintesi e alla valutazione biologica di modulatori del proteasoma. La prima parte del lavoro ha riguardato la progettazione di nuovi inibitori non peptidici ottenuti tramite ciclizzazione di strutture peptidiche per formare un core piperazinico funzionalizzato con gruppi capaci di interagire con il sito catalitico. I composti sono stati valutati in vitro su cellule HeLa mediante due sonde fluorescenti specificamente sviluppate. Parallelamente, lo screening di una libreria interna di composti su quattro linee cellulari ha permesso di individuare sia inibitori sia attivatori del proteasoma. È stata identificata una nuova classe di derivati 2-ossochinoxalinici con moderata attività inibitoria, pur privi di gruppi tipicamente deputati all’interazione con il sito catalitico, oltre a un composto particolarmente promettente dotato di significativa attività attivante in tutte le linee testate. Questi hit sono attualmente oggetto di saggi secondari volti a chiarirne il meccanismo d’azione. Durante un periodo di ricerca presso l’Università di Alcalá è stata inoltre esplorata una strategia terapeutica alternativa per le malattie neurodegenerative, focalizzata sulla sintesi di una molecola multivalente progettata per il trattamento di Alzheimer e Parkinson. L’approccio integra in un’unica struttura diversi farmacofori mirati a vie patologiche complementari, con l’obiettivo di ridurre la politerapia e minimizzare gli effetti collaterali. La valutazione biologica del composto sarà oggetto di futuri studi in vitro.

The ubiquitin–proteasome system represents a fundamental mechanism for intracellular protein degradation, playing a central role in the maintenance of cellular homeostasis. This system, operating through two distinct phases, ensures the balance of the cellular proteome through the correct recognition, digestion, and elimination of unfolded or mutated proteins. The proteasome-regulated proteolytic process is a highly significant pharmaceutical target, as its dysfunction has been implicated in numerous pathological conditions. In particular, alterations in proteasome activity have been associated with: • Cancer, notably acute myeloid leukemia, which appears to be linked to excessive proteasome activity. This multienzymatic complex represents a promising pharmacological target for therapeutic strategies aimed at inhibiting uncontrolled cell proliferation through the selective degradation of regulatory proteins (CDKs and IκBs). • Neurodegenerative disorders, such as Alzheimer’s disease, Parkinson’s disease, and dementia. These conditions share a common proteostasis imbalance and are characterized by the accumulation of dysfunctional proteins, leading to oxidative stress and, frequently, cell death. Proteasome activation therefore represents a promising strategy to restore intracellular homeostasis by promoting the removal of toxic aggregates. Proteasome inhibition has been extensively studied, and several drugs are currently used in the treatment of acute myeloid leukemia. However, many of these compounds, often peptide-based, are limited by rapid metabolism, potential immunogenicity, and adverse effects such as peripheral neuropathy and hematologic or gastrointestinal toxicities. For this reason, current research aims to develop novel inhibitors with improved safety and pharmacological profiles. Conversely, positive modulation of the proteasome is a relatively recent therapeutic approach, and although several small-molecule activators have been identified, their mechanisms of action remain only partially understood. This doctoral thesis focuses on the synthesis and biological evaluation of proteasome modulators. The initial work involved the design and preparation of novel non-peptidic inhibitors obtained through the cyclization of peptidic structures to generate a piperazine core, to which functional groups capable of interacting with the proteasome catalytic site were appended. These compounds were tested in vitro on HeLa cells using two fluorescent peptide-based probes specifically developed for the assays. Parallel biological screening of an in-house compound library across four cell lines enabled the identification of both proteasome inhibitors and activators. This investigation revealed a new class of 2-oxoquinoxalinic derivatives showing moderate inhibition despite lacking canonical catalytic-site-directed groups, as well as a promising small molecule displaying consistent proteasome-activating activity in all tested cell lines. These hits are currently undergoing secondary assays to elucidate their mechanisms of action. During a research period at the University of Alcalá, an additional therapeutic strategy for neurodegenerative diseases was explored. This work focused on the synthesis of a multivalent molecule integrating multiple pharmacophores into a single scaffold, with the aim of targeting distinct pathological pathways involved in Alzheimer’s and Parkinson’s diseases. This approach is intended to reduce the need for polypharmacy and minimize adverse effects. The biological evaluation of this compound will be conducted in forthcoming in vitro studies.