La scoperta degli antibiotici ha rivoluzionato la medicina moderna, riducendo drasticamente la gravità di molte malattie infettive. Tuttavia, l’abuso e uso improprio di questi farmaci ha portato ad un aumento della resistenza antimicrobica (AMR). L’AMR richiede la continua scoperta di nuovi antibiotici. Un approccio promettente per lo sviluppo di nuovi farmaci è rappresentato dall’impiego di peptidi antimicrobici (AMP), i quali sono caratterizzati da un ampio spettro d’azione e una bassa attitudine a indurre AMR.1 Questi possono agire attraverso diversi meccanismi, come l’interazione con le membrane cellulari o la risposta immunitaria innata (immunità nutrizionale). Grazie a quest’ultima, gli AMP possono sequestrare nutrienti metallici come zinco, rame o ferro, interferendo con l’omeostasi dei patogeni. Tuttavia, possono presentare alcuni svantaggi, come l’instabilità metabolica e un’attività antimicrobica relativamente inferiore rispetto agli antibiotici tradizionali. Un modo per superare questi limiti è rappresentato dalla progettazione razionale di peptidomimetici, derivati peptidici ottenuti dall’introduzione di modifiche chimiche nella sequenza peptidica. In questa tesi, sono stati esaminati approfonditamente gli effetti ottenuti dall’introduzione di protezioni terminali, 2 D-amminoacidi o sostituzioni di amminoacidi specifici,3,4 sulle capacità chelanti, stabilità enzimatica e attività antimicrobica di peptidi naturali. Per caratterizzazione gli equilibri in soluzione dei complessi metallici è richiesto un approccio multi-tecnica. La spettrometria di massa e le titolazioni potenziometriche sono utilizzate per determinare la stechiometria e la stabilità termodinamica dei complessi formati in diverse condizioni sperimentali; tecniche spettroscopiche, come la spettrofotometria UV-Vis, il dicroismo circolare (CD) e la risonanza paramagnetica elettronica, danno indicazioni sulla geometria di coordinazione e sui siti di legame. Inoltre, le misure di CD nel lontano UV forniscono informazioni sulla struttura secondaria. La stabilità metabolica è stata testata mediante incubazione in plasma umano, seguita da misure HPLC; studi biologici hanno completato i dati strutturali e termodinamici valutando l’attività antimicrobica e chiarendo il meccanismo d’azione, in particolare il ruolo del sequestro di ioni metallici nell’immunità nutrizionale. Inoltre, il confronto tra diversi analoghi peptidici ha aiutato a chiarire il ruolo di specifici residui della sequenza peptidica, non sempre direttamente coinvolti nella complessazione ma che influenzano la geometria del complesso e contribuiscono alla sua stabilità. I risultati dimostrano l’efficacia delle strategie utilizzate per migliorare la stabilità dei peptidi nei confronti degli enzimi proteolitici, regolare struttura e stabilità dei loro complessi metallici, aumentare l’attività e la selettività antimicrobica verso funghi, batteri e anche virus. I saggi antimicrobici hanno confermato il ruolo cruciale della formazione del complesso metallo-peptide.5 Nel complesso, questi risultati dimostrano che i peptidi indagati e i loro complessi rappresentano candidati promettenti come potenziali agenti terapeutici. Inoltre, la dettagliata descrizione termodinamica e strutturale della coordinazione degli ioni metallici ha permesso un progresso significativo nella conoscenza della chimica bioinorganica,6 chiarendo parzialmente il ruolo di questi metalli nell’attività antimicrobica e aprendo la strada a strategie per modulare l’efficacia e la selettività di nuovi farmaci antimicrobici. Bibliografia: [1] Browne, et al. Int. J. Mol. Sci. 2020, 21(19). [2] D’Accolti, et al. Sci. Rep. 2023, 13(1), 18228. [3] Leveraro, et al. Dalton Trans. 2024. [4] Leveraro, et al. J. Inorg. Biochem. 2025, 262, 112761. [5] Caproni, et al. Anal. Biochem. 2025, 700, 115784. [6] Leveraro, et al. Inorg. Chem. 2025, 64(13), 6751-6760.
The discovery of antibiotics changed modern medicine, both drastically reducing the severity of many bacterial diseases and allowing progress in other medical fields, like surgery. However, the abuse and misuse of these drugs has led to an increase of antimicrobial resistance (AMR). AMR calls for the continuous discovery and introduction of new antibiotics. A promising substrate for the development of new drugs is represented by antimicrobial peptides (AMPs), which are characterized by a broad spectrum of activities and a low attitude to induce AMR.1 In fact, they can act through different mechanisms, such as the interaction with cell membranes or the innate immune response named “nutritional immunity”. Through the latter mechanism, AMPs can sequester metallic nutrients such as zinc, copper or iron, interfering with the homeostasis of the pathogens. However, they present some drawbacks, including metabolic instability and relatively lower antimicrobial activity, compared to traditional antibiotics. To overcome these limitations, a rational design approach, employing peptidomimetics, is fruitful. Peptidomimetics are peptide derivatives obtained by introducing some chemical modification in the peptide sequence, e.g. the incorporation of unnatural or D-amino acids. In this thesis, the effects of incorporating terminal protections,2 amino acid substitutions3-4 or D-amino acids on the metal binding ability, the enzymatic stability and the antimicrobial activity of different natural peptides have been thoroughly examined. The comprehensive characterization of metal-complexes solution-equilibria requires a multi-technique approach. Mass spectrometry and potentiometric titrations have been used to determine the stoichiometry and the thermodynamic stability of the formed complexes, under different experimental conditions; spectroscopic techniques, including UV-Vis spectrophotometry, circular dichroism (CD) and electron paramagnetic resonance, gave hints on coordination geometry and binding sites. Moreover, Far-UV CD measurements provided information on the secondary structure (e.g., α-helices formation). Resistance to enzymatic degradation was tested through incubation in human plasma followed by HPLC measurements; biological studies complemented the structural and thermodynamic data by evaluating the antimicrobial activity and clarifying the mechanism of action, particularly the role of metal ion sequestration in nutritional immunity. Moreover, the comparison between different peptide analogues helped clarify the role of specific residues of the peptide sequence, not always directly involved in complexation but rather influencing the complex geometry and contributing to its stability. The findings demonstrate the efficacy of the used strategies to enhance peptide stability against proteolytic enzymes, finely tune structure and stability of their metal complexes and increase antimicrobial activity and selectivity towards fungi, bacteria and also viruses. Antimicrobial assays confirmed the crucial role of metal-peptide complex-formation.5 Overall, these results prove that the investigated peptides and their complexes represent promising candidates as potential therapeutic agents. In addition, the detailed thermodynamic and structural description of metal ion coordination has significantly advanced the general knowledge of bioinorganic chemistry,6 partially elucidating the role of these metals in antimicrobial activity and paving the way for strategies to modulate the efficacy and selectivity of new antimicrobial drugs. References: [1] Browne, et al., International journal of molecular sciences 2020, 21(19). [2] D’Accolti, et al., Scientific Reports 2023, 13(1), 18228. [3] Leveraro, et al., Dalton Transactions 2024. [4] Leveraro, et al, Journal of Inorganic Biochemistry 2025, 262, 112761. [5] Caproni, et al. Analytical Biochemistry 2025, 700, 115784. [6] Leveraro, et al. Inorganic Chemistry 2025, 64(13), 6751-6760.
Novel metallo-peptides to combat antimicrobial resistance: from design to functional characterization through a multi-technique analytical approach
LEVERARO, SILVIA
2026
Abstract
La scoperta degli antibiotici ha rivoluzionato la medicina moderna, riducendo drasticamente la gravità di molte malattie infettive. Tuttavia, l’abuso e uso improprio di questi farmaci ha portato ad un aumento della resistenza antimicrobica (AMR). L’AMR richiede la continua scoperta di nuovi antibiotici. Un approccio promettente per lo sviluppo di nuovi farmaci è rappresentato dall’impiego di peptidi antimicrobici (AMP), i quali sono caratterizzati da un ampio spettro d’azione e una bassa attitudine a indurre AMR.1 Questi possono agire attraverso diversi meccanismi, come l’interazione con le membrane cellulari o la risposta immunitaria innata (immunità nutrizionale). Grazie a quest’ultima, gli AMP possono sequestrare nutrienti metallici come zinco, rame o ferro, interferendo con l’omeostasi dei patogeni. Tuttavia, possono presentare alcuni svantaggi, come l’instabilità metabolica e un’attività antimicrobica relativamente inferiore rispetto agli antibiotici tradizionali. Un modo per superare questi limiti è rappresentato dalla progettazione razionale di peptidomimetici, derivati peptidici ottenuti dall’introduzione di modifiche chimiche nella sequenza peptidica. In questa tesi, sono stati esaminati approfonditamente gli effetti ottenuti dall’introduzione di protezioni terminali, 2 D-amminoacidi o sostituzioni di amminoacidi specifici,3,4 sulle capacità chelanti, stabilità enzimatica e attività antimicrobica di peptidi naturali. Per caratterizzazione gli equilibri in soluzione dei complessi metallici è richiesto un approccio multi-tecnica. La spettrometria di massa e le titolazioni potenziometriche sono utilizzate per determinare la stechiometria e la stabilità termodinamica dei complessi formati in diverse condizioni sperimentali; tecniche spettroscopiche, come la spettrofotometria UV-Vis, il dicroismo circolare (CD) e la risonanza paramagnetica elettronica, danno indicazioni sulla geometria di coordinazione e sui siti di legame. Inoltre, le misure di CD nel lontano UV forniscono informazioni sulla struttura secondaria. La stabilità metabolica è stata testata mediante incubazione in plasma umano, seguita da misure HPLC; studi biologici hanno completato i dati strutturali e termodinamici valutando l’attività antimicrobica e chiarendo il meccanismo d’azione, in particolare il ruolo del sequestro di ioni metallici nell’immunità nutrizionale. Inoltre, il confronto tra diversi analoghi peptidici ha aiutato a chiarire il ruolo di specifici residui della sequenza peptidica, non sempre direttamente coinvolti nella complessazione ma che influenzano la geometria del complesso e contribuiscono alla sua stabilità. I risultati dimostrano l’efficacia delle strategie utilizzate per migliorare la stabilità dei peptidi nei confronti degli enzimi proteolitici, regolare struttura e stabilità dei loro complessi metallici, aumentare l’attività e la selettività antimicrobica verso funghi, batteri e anche virus. I saggi antimicrobici hanno confermato il ruolo cruciale della formazione del complesso metallo-peptide.5 Nel complesso, questi risultati dimostrano che i peptidi indagati e i loro complessi rappresentano candidati promettenti come potenziali agenti terapeutici. Inoltre, la dettagliata descrizione termodinamica e strutturale della coordinazione degli ioni metallici ha permesso un progresso significativo nella conoscenza della chimica bioinorganica,6 chiarendo parzialmente il ruolo di questi metalli nell’attività antimicrobica e aprendo la strada a strategie per modulare l’efficacia e la selettività di nuovi farmaci antimicrobici. Bibliografia: [1] Browne, et al. Int. J. Mol. Sci. 2020, 21(19). [2] D’Accolti, et al. Sci. Rep. 2023, 13(1), 18228. [3] Leveraro, et al. Dalton Trans. 2024. [4] Leveraro, et al. J. Inorg. Biochem. 2025, 262, 112761. [5] Caproni, et al. Anal. Biochem. 2025, 700, 115784. [6] Leveraro, et al. Inorg. Chem. 2025, 64(13), 6751-6760.I documenti in SFERA sono protetti da copyright e tutti i diritti sono riservati, salvo diversa indicazione.
