Immune mechanisms in development of solid tumors: focus on inflammasome-3 modulation.

La malignità dipende da cellule tumorali e infiltranti che formano un peculiare microambiente. L’infiammazione s’innesca a livelli omeostatici ma, quando eccessiva e duratura, esita in immunotolleranza con massiccio reclutamento di leucociti che promuove la crescita tumorale. NLRP3 ha ruolo chiave nell'assemblaggio dell'inflammasoma-3 per la maturazione/secrezione di IL-1β/IL-18. P2X7R rileva livelli elevati di eATP portando ad afflussi (Ca2+/Na+) e efflussi (K+) attivando NLRP3. Con l’infiammazione, P2X7 e NLRP3 co-localizzati sulle MAMs agiscono in sinergia mentre la proteina PML ne riduce l’interazione mitigandone gli effetti. Per definire questa liaison infiammatoria e gli effetti sullo sviluppo di tumori solidi, topi femmina C57BL/6 wt e PML-/- sono stati così trattati: A) 106 cellule di melanoma B16-F10 sono state iniettate s.c. e i tumori prelevati 14 gg. dopo, fissati in Bouin e inclusi in paraffina. Sezioni istologiche (6 μm) sono state colorate con ematossilina/eosina (H/E) o con ABC-immunoperossidasi intensificata con nichel (IHC) mediante anticorpi (P2X7, NLRP3, IL-1β, CD2O6, CD3ε). I tumori sono stati analizzati anche dopo radioterapia a singola dose (2 o 10 Gy). In topi PML-/- non irradiati sono stati rilevati maggiore crescita tumorale, reclutamento di cellule infiammatorie e polarizzazione M2 (immunotolleranza) che in controlli wt. In modo inatteso, sia in topi PML-/- e wt irradiati 2 Gy gli infiltrati infiammatori (M2) sono stati maggiori vs. i controlli, mentre la crescita tumorale è ridotta solo nei wt. Diversamente, l'irradiazione 10 Gy ha ridotto crescita tumorale e infiammazione in entrambi i gruppi. B) Un modello di colite è stato indotto con 2.5% destrano sodio solfato (DSS; 7 gg. ad libitum in acqua da bere seguiti da 3 gg. di sospensione). Al giorno 10, gli intestini (dal cieco al retto) sono stati prelevati, fissati e inclusi e le sezioni colorate con H/E o IHC (PML, P2X7, NLRP3, IL-1β, F4/80, iNOS, CD206, CD3ε). Uno score istopatologico ha rivelato chiara infiammazione nel gruppo wt trattato, aggravata nei topi PML-/- associata a sovra-espressione di proteine infiammatorie. C) Un modello di carcinoma colo-rettale (CRC) è stato indotto con azossimetano (7.4 mg/kg i.p.) seguito da DSS 2.5% in acqua da bere per 3 cicli di 5 gg. alternati a 14 gg. di sospensione. Gli intestini sono stati campionati e processati e le sezioni colorate con H/E o IHC (P2X7, NLRP3, IL-1β, F4/80, iNOS, CD2O6, PCNA). Lo score ha rivelato iperinfiammazione nel gruppo wt trattato, aggravata nei topi PML-/-, associata a sovra-espressione di proteine infiammatorie. D) Un altro modello di CRC è stato indotto con iniezione intracecale di 2x106 cellule MC38 (cancro colon murino). I tumori sono stati rimossi dopo 28 gg. e le sezioni colorate con H/E o IHC (PML, P2X7, NLRP3, IL-1β, F4/80, iNOS, CD206). Nei topi PML-/- i tumori hanno mostrato maggior infiltrato infiammatorio periferico e polarizzazione M2 rispetto ai wt. Gli esperimenti A-D hanno studiato l'assenza di PML nell'ospite, mentre l'uso di cellule MC38 PML-/- (clone selezionato dopo CRISPR-Cas9) in topi wt ha indagato la mancanza di PML nelle cellule tumorali. E) Tumori sono stati raccolti e processati per colorare sezioni con H/E o IHC (P2X7, NLRP3, IL-1β, F4/80, iNOS, CD206). I tumori generati da cellule PML-/- hanno mostrato maggiore infiltrato infiammatorio periferico (principalmente M2) rispetto a quelli da cellule PML+/+. In sintesi, è emersa la rilevanza di PML nella regolazione di NLRP3 e nella progressione tumorale (nel microambiente e nelle cellule tumorali). Infine, ricerche in corso su lamantini selvatici (a Jacksonville Univ, US) mirano a correlare tramite bioinformatica (Kbase, R) espressione di PML, P2X7 e NLRP3 (trascrittomi da sangue intero), stato di salute (via ispezione e analisi del sangue) e stress ambientale (attività umane, cambiamenti dell'habitat).

Tumor malignancy arises from cancer and non-malignant cells that infiltrate and surround the lesion to form a peculiar microenvironment. The inflammation should be an innate response at homeostatic levels but, when too intense and prolonged, leads to immune tolerance with massive leukocytes recruitment that promotes tumor growth. The NOD-Like Receptor P3 (NLRP3) has a key regulatory role on inflammasome-3 assembly for IL-1β and IL-18 maturation/secretion. The P2X7 receptor senses high extracellular ATP concentrations allowing Ca2+/Na+ influx and K+ efflux leading to NLRP3 activation. Under inflammation, P2X7 and NLRP3 co-localized on mitochondrial-associated membranes act synergically, while promyelocytic leukemia protein (PML) lessens this interaction to mitigate the pro-inflammatory effects. To define this inflammatory liaison and its effects on solid tumors development, wild-type (wt) and PML-/- C57BL/6 female mice were treated as follows: A) 106 B16-F10 melanoma cells were injected s.c. then tumors were harvested 14 days later, fixed in Bouin and paraffin-embedded. Histological sections (6 μm) were stained with hematoxylin and eosin (H/E) or by ABC-immunoperoxidase with nickel enhancement (IHC) using antibodies against P2X7, NLRP3, IL-1β, CD206 and CD3ε. Tumor growth was also analysed after radiotherapy at different single doses (2 or 10 Gy). In non-irradiated PML-/- mice we detected significantly higher tumor growth, inflammatory cells recruitment and M2 polarization toward tolerance than in wt group. Surprisingly, in both PML-/- and wt mice irradiated at 2 Gy inflammatory infiltrates (M2) were larger than in respective controls, whereas tumor growth declined in wt mice only. Otherwise, 10 Gy irradiation reduced tumor growth and inflammation in both groups. B) A colitis model was induced by 2.5% dextran sodium sulfate (DSS; 7 days ad libitum in drinking water followed by 3-days suspension). On day 10, intestines (cecum to rectum) were dissected, fixed and embedded and sections stained with H/E and IHC (PML, P2X7, NLRP3, IL-1β, F4/80, iNOS, CD206 and CD3ε). Histopathological scoring unveiled patent inflammation in DSS-treated wt mice, significantly worsened in PML-/- mice associated with inflammatory proteins overexpression. C) A colorectal cancer (CRC) model was exploited by azoxymethane (7.4 mg/kg i.p.) followed by 2.5% DSS in water for three 5-days cycles separated by a 2-week suspension. Intestines were dissected and processed as above and sections stained with H/E and IHC (P2X7, NLRP3, IL-1β, F4/80, iNOS, CD206 and PCNA). A scoring unveiled hyperinflammation in treated wt group, worsened in PML-/- mice associated with inflammatory proteins overexpression. D) A further CRC model was run by intracecal injection of 2x106 MC38 murine colon cancer cells. The tumors were removed 4 weeks later and sections stained with H/E and IHC (PML, P2X7, NLRP3, IL-1β, F4/80, iNOS and CD206). In PML-/- mice tumors had higher peripheral inflammatory infiltrate and M2 polarization compared with wt controls. Experiments A-D dealt with PML lack in the host, while inoculation of PML-/- MC38 cells (clone AB22 selected by CRISPR-Cas9) in wt mice allowed analysing PML lack in cancer cells. E) The tumors were collected and treated as usual to stain sections with H/E and IHC (P2X7, NLRP3, IL-1β, F4/80, iNOS and CD206). Tumors derived from PML-/- cells had higher peripheral inflammatory infiltrate (mainly M2) than those from PML+/+ cells. In conclusion, the paramount relevance of PML control on NLRP3 activity and tumor progression was underlined both in tumor microenvironment and cells. Finally, ongoing research on wild manatees (at Jacksonville Univ, US) aimed to correlate through bioinformatics (Kbase and R) PML, P2X7 and NLRP3 expression (whole blood transcriptomes), health (scored by inspection and blood test) and environmental stress (human activity, habitat change).