Il carcinoma a cellule di Merkel (CCM) è un tumore neuroendocrino della pelle raro e altamente aggressivo, con un’incidenza di circa 0.3–1.6 casi per 100,000 individui a livello mondiale. Le opzioni terapeutiche attualmente disponibili rimangono limitate e frequentemente seguite da recidiva, mentre quasi il 50% dei pazienti metastatici mostra resistenza al trattamento con immunoterapia. È quindi urgentemente necessario sviluppare nuove e più efficaci strategie terapeutiche. La deacetilazione istonica aberrante mediata dall’overespressione dell’istone deacetilasi (HDACs) contribuisce al silenziamento dei geni oncosoppressori e promuove la trasformazione cellulare. Gli inibitori delle HDAC (iHDACs), come panobinostat, stanno emergendo come promettenti agenti antitumorali, in grado di ripristinare l’acetilazione istonica e riattivare geni repressi epigeneticamente. L’attività di panobinostat nel CCM rimane inesplorata. L’obbiettivop di questa tesi è quello di testare l’ipotesi che panobinostat eserciti effetti antiproliferativi e pro-apoptotici nelle cellule di CCM. Quattro linee cellulari di CCM, MCC13, MCC26, PeTa e WaGa, insieme a fibroblasti dermici umani come controllo non tumorale, sono stati trattati con panobinostat e sottoposti ad una serie di saggi in vitro. Le risposte cellulari sono state valutate attraverso saggi di vitalità, proliferazione, crescita di colonie e di crescita in 3D mediante sferoidi. L’induzione dell’apoptosi è stata studiata tramite qPCR array e western blot di marcatori apoptotici. L’attività enzimatica globale delle HDAC e lo stato di acetilazione dei residui di lisina dell’istone H3 sono stati analizzati per caratterizzare il rimodellamento epigenetico. Inoltre, l’espressione genica e proteica dei componenti del complesso maggiore di istocompatibilità (MHC) è stata quantificata tramite droplet digital PCR e western blot. Infine, il profilo trascrizionale è stato valutato mediante RNA sequencing per definire le variazioni dell’espressione genica su larga scala indotte dal trattamento con panobinostat. Panobinostat ha mostrato una notevole attività antiproliferativa in tutte le cellule CCM a concentrazioni nanomolari. Il farmaco ha ridotto significativamente vitalità, capacità di formare colonie e migrazione e ha compromesso la crescita degli sferoidi. Le analisi dei pathway apoptotici hanno rivelato una marcata attivazione trascrizionale di geni correlati alle caspasi e una forte induzione delle proteine PARP-1, caspasi-3 e caspasi-7 clivate. Panobinostat ha inoltre indotto una potente inibizione dell’attività globale delle HDAC e ha ripristinato molteplici marcatori di acetilazione dell’istone H3, inclusi acetil-istone H3 lisina 9 (H3K9ac), 14 (H3K14ac), 18 (H3K18ac) e 27 (H3K27ac). È importante evidenziare che il trattamento ha riattivato diversi geni correlati al MHC, tra cui HLA-A, HLA-B, B2M, TAP1/2 e MICA, supportando la capacità di panobinostat di aumentare l’immunogenicità del CCM. L’RNA sequencing ha inoltre rivelato una risposta trascrizionale comprendente upregolazione di geni legati al differenziamento neuroendocrino, tra cui SYP, STMN2, SCN3A, MSI1 e DPYSL5, e downregolazione di geni pro-tumorali e metabolici, quali IGF2, DDR2, PSAT1, ASNS, SLC7A11 e TRIB3, indicando una transizione verso uno stato cellulare più differenziato e meno proliferativo. Nel complesso, questo lavoro fornisce la prima dimostrazione completa che panobinostat esercita un’attività antitumorale potente e multifattoriale nell’MCC, agendo attraverso induzione dell’apoptosi, riprogrammazione epigenetica, ripristino dell’immunogenicità e promozione della ri-differenziazione neuronale. Questi risultati supportano la necessità di ulteriori studi preclinici su panobinostat come promettente strategia terapeutica per il CCM avanzato o refrattario ai trattamenti.
Merkel cell carcinoma (MCC) is a rare and highly aggressive neuroendocrine skin cancer with an incidence of approximately 0.3–1.6 cases per 100,000 individuals worldwide. Current therapeutic options, such as surgical resection combined with adjuvant radiotherapy, remain limited and frequently followed by recurrence, while nearly 50% of metastatic patients exhibit primary or acquired resistance to immunotherapy. Aberrant histone deacetylation driven by overexpression of histone deacetylases (HDACs) contributes to the silencing of tumor-suppressor genes and promotes malignant transformation. HDAC inhibitors (iHDACs), such as panobinostat, are emerging as promising anticancer agents capable of restoring histone acetylation and reactivating epigenetically repressed genes. Despite encouraging in vitro data obtained with other iHDACs, including domatinostat and vorinostat, the activity of panobinostat in MCC remains unexplored. The aim of the thesis is to test the hypothesis that panobinostat exerts antiproliferative and pro-apoptotic effects in MCC cells. Four MCC cell lines, such as MCC13, MCC26, PeTa and WaGa, and human dermal fibroblasts control cells were treated with panobinostat and subjected to a comprehensive panel of in vitro assays. Cellular responses were evaluated through viability, proliferation, colony forming and migration assays, as well as 3D spheroid growth/proliferation analyses. Apoptosis induction was assessed by qPCR arrays of apoptosis-related genes and western blot analysis of apoptotic markers. Global HDAC enzymatic activity and the acetylation status of acetyl-histone H3 lysine residues were measured to characterize epigenetic remodeling. Moreover, gene and protein expression of major histocompatibility complex (MHC)-related genes were evaluated by droplet digital PCR and western blot. Lastly, transcriptomic profiling through RNA sequencing was performed to define genome-wide gene expression changes induced by panobinostat. Panobinostat displayed remarkable antiproliferative activity across all MCC cells, with low-nanomolar IC₅₀ values and minimal effects on control cells. The compound significantly reduced viability, clonogenicity and migration, and impaired both spheroid growth and proliferation, demonstrating a broad inhibitory effect on key malignant traits. Apoptotic pathway analyses revealed extensive transcriptional activation of caspase-related genes and strong induction of cleaved PARP-1, caspase-3 and caspase-7, confirming apoptosis as a major downstream effect. Panobinostat also induced potent inhibition of global HDAC activity and restored multiple histone H3 acetylation marks, including acetyl-histone H3 lysine 9 (H3K9ac), 14 (H3K14ac), 18 (H3K18ac) and 27 (H3K27ac) in MCC cells. Importantly, treatment reactivated several MHC-related genes, including HLA-A, HLA-B, B2M, TAP1/2 and MICA, supporting the capacity of panobinostat to enhance MCC immunogenicity. RNA sequencing conducted in panobinostat-treated WaGa and MCC13 cells further revealed a convergent transcriptional response characterized by reactivation of neuronal/neuroendocrine differentiation programs and suppression of metabolic, proliferative and stress-response pathways. Upregulation of lineage-specific neuronal markers, including SYP, STMN2, SCN3A, MSI1 and DPYSL5, was accompanied by downregulation of pro-tumoral and metabolic genes such as IGF2, DDR2, PSAT1, ASNS, SLC7A11 and TRIB3, indicating a transition toward a more differentiated and less proliferative cell state. Overall, this work provides the first comprehensive demonstration that panobinostat exerts potent and multifaceted antitumor activity in MCC, through apoptosis induction, epigenetic reprogramming, immunogenicity restoration and promotion of neuronal re-differentiation. These findings support further preclinical exploration of panobinostat, alone or in combination with immunotherapy, as a promising therapeutic strategy for advanced or treatment-refractory MCC.
HISTONE DEACETYLASE INHIBITOR PANOBINOSTAT INDUCES ANTIPROLIFERATIVE AND PRO-APOPTOTIC EFFECTS IN MERKEL CELL CARCINOMA CELLS
CERVELLERA, CHRISTIAN FELICE
2026
Abstract
Il carcinoma a cellule di Merkel (CCM) è un tumore neuroendocrino della pelle raro e altamente aggressivo, con un’incidenza di circa 0.3–1.6 casi per 100,000 individui a livello mondiale. Le opzioni terapeutiche attualmente disponibili rimangono limitate e frequentemente seguite da recidiva, mentre quasi il 50% dei pazienti metastatici mostra resistenza al trattamento con immunoterapia. È quindi urgentemente necessario sviluppare nuove e più efficaci strategie terapeutiche. La deacetilazione istonica aberrante mediata dall’overespressione dell’istone deacetilasi (HDACs) contribuisce al silenziamento dei geni oncosoppressori e promuove la trasformazione cellulare. Gli inibitori delle HDAC (iHDACs), come panobinostat, stanno emergendo come promettenti agenti antitumorali, in grado di ripristinare l’acetilazione istonica e riattivare geni repressi epigeneticamente. L’attività di panobinostat nel CCM rimane inesplorata. L’obbiettivop di questa tesi è quello di testare l’ipotesi che panobinostat eserciti effetti antiproliferativi e pro-apoptotici nelle cellule di CCM. Quattro linee cellulari di CCM, MCC13, MCC26, PeTa e WaGa, insieme a fibroblasti dermici umani come controllo non tumorale, sono stati trattati con panobinostat e sottoposti ad una serie di saggi in vitro. Le risposte cellulari sono state valutate attraverso saggi di vitalità, proliferazione, crescita di colonie e di crescita in 3D mediante sferoidi. L’induzione dell’apoptosi è stata studiata tramite qPCR array e western blot di marcatori apoptotici. L’attività enzimatica globale delle HDAC e lo stato di acetilazione dei residui di lisina dell’istone H3 sono stati analizzati per caratterizzare il rimodellamento epigenetico. Inoltre, l’espressione genica e proteica dei componenti del complesso maggiore di istocompatibilità (MHC) è stata quantificata tramite droplet digital PCR e western blot. Infine, il profilo trascrizionale è stato valutato mediante RNA sequencing per definire le variazioni dell’espressione genica su larga scala indotte dal trattamento con panobinostat. Panobinostat ha mostrato una notevole attività antiproliferativa in tutte le cellule CCM a concentrazioni nanomolari. Il farmaco ha ridotto significativamente vitalità, capacità di formare colonie e migrazione e ha compromesso la crescita degli sferoidi. Le analisi dei pathway apoptotici hanno rivelato una marcata attivazione trascrizionale di geni correlati alle caspasi e una forte induzione delle proteine PARP-1, caspasi-3 e caspasi-7 clivate. Panobinostat ha inoltre indotto una potente inibizione dell’attività globale delle HDAC e ha ripristinato molteplici marcatori di acetilazione dell’istone H3, inclusi acetil-istone H3 lisina 9 (H3K9ac), 14 (H3K14ac), 18 (H3K18ac) e 27 (H3K27ac). È importante evidenziare che il trattamento ha riattivato diversi geni correlati al MHC, tra cui HLA-A, HLA-B, B2M, TAP1/2 e MICA, supportando la capacità di panobinostat di aumentare l’immunogenicità del CCM. L’RNA sequencing ha inoltre rivelato una risposta trascrizionale comprendente upregolazione di geni legati al differenziamento neuroendocrino, tra cui SYP, STMN2, SCN3A, MSI1 e DPYSL5, e downregolazione di geni pro-tumorali e metabolici, quali IGF2, DDR2, PSAT1, ASNS, SLC7A11 e TRIB3, indicando una transizione verso uno stato cellulare più differenziato e meno proliferativo. Nel complesso, questo lavoro fornisce la prima dimostrazione completa che panobinostat esercita un’attività antitumorale potente e multifattoriale nell’MCC, agendo attraverso induzione dell’apoptosi, riprogrammazione epigenetica, ripristino dell’immunogenicità e promozione della ri-differenziazione neuronale. Questi risultati supportano la necessità di ulteriori studi preclinici su panobinostat come promettente strategia terapeutica per il CCM avanzato o refrattario ai trattamenti.I documenti in SFERA sono protetti da copyright e tutti i diritti sono riservati, salvo diversa indicazione.
