La proteina della leucemia promielocitica (PML) è un noto oncosoppressore, storicamente descritta come una proteina nucleare. Studi recenti hanno rivelato che PML è localizzata anche in compartimenti extra-nucleari, in particolare a livello delle membrane associate ai mitocondri (MAMs), siti di contatto specializzati tra reticolo endoplasmatico (RE) e mitocondri. In questa sede, PML regola diversi processi fondamentali, tra cui morte cellulare, autofagia e trasferimento del calcio dal RE ai mitocondri. Questa tesi di dottorato esplora un ruolo aggiuntivo e meno caratterizzato di PML nelle MAMs: la regolazione delle risposte immunitarie durante processi neuroinfiammatori, con particolare attenzione all’attivazione dell’inflammasoma NLRP3. L’ipotesi centrale è che l’assenza o la mutazione di PML esasperino l’attivazione immunitaria, contribuendo così all’insorgenza e alla progressione delle malattie neurodegenerative, in particolare della sclerosi multipla. Analizzando l’asse PML–NLRP3, questo lavoro mira non solo a chiarire le basi meccanicistiche della regolazione dell’inflammasoma NLRP3, ma anche a identificare potenziali strategie terapeutiche mirate a questo pathway. L’approccio sperimentale ha utilizzato colture primarie di glia mista, ottenute dalle cortecce di topi wildtype (PML+/+) e PML-/-. Dopo l’ottimizzazione dei protocolli di trattamento e stimolazione mediante saggi di vitalità cellulare, diverse tecniche — tra cui Western blotting, immunofluorescenza ed immunodosaggi — sono state impiegate per valutare le differenze nell’attivazione di NLRP3 tra i due genotipi. Successivamente, le cellule sono state trattate con un pannello di cinque nuovi inibitori dell’inflammasoma NLRP3, due dei quali sviluppati utilizzando una tecnologia PROTAC innovativa. I risultati presentati in questa tesi evidenziano un’interazione precedentemente non riconosciuta tra PML e NLRP3, che influenza in modo significativo la segnalazione neuroinfiammatoria. Parallelamente, dati preliminari indicano che i composti testati attenuano le risposte mediate da NLRP3. Complessivamente, questi risultati ampliano la nostra comprensione delle funzioni extra-nucleari di PML e forniscono nuove intuizioni sulla regolazione dell’inflammasoma NLRP3, con possibili implicazioni per lo sviluppo di terapie mirate nella sclerosi multipla e in disturbi correlati.
Promyelocytic Leukemia Protein (PML) is a well-established tumor suppressor that has historically been described as a nuclear protein. Recent studies have revealed that PML is also localized in extranuclear compartments, particularly at mitochondria-associated membranes (MAMs), which are specialized contact sides between the endoplasmic reticulum (ER) and mitochondria. Here, PML regulates several fundamental processes including cell death, autophagy and the transfer of calcium from ER to mitochondria. This doctoral thesis explores an additional and less characterized role of PML at MAMs: the regulation of immune responses during neuroinflammatory processes, with a specific focus on the activation of the NLRP3 inflammasome. The central hypothesis is that the absence or mutation of PML exacerbates immune activation, thereby contributing to the onset and progression of neurodegenerative diseases, particularly Multiple Sclerosis (MS). By dissecting the PML-NLRP3 axis, this work aims not only to elucidate the mechanistic basis of NLRP3 inflammasome regulation, but also to uncover potential therapeutic strategies targeting this pathway. The experimental approach involved primary mixed glia cultures, obtained from cortices of wild type (PML+/+) and PML-/- mice. After optimization of treatment and stimulation protocols through cell viability assays, several techniques, including Western blotting, Immunofluorescence, and Immunoassays, were employed to assess differences in NLRP3 activation between the two genotypes. Subsequently, cells were treated with a panel of five novel NLRP3 inflammasome inhibitors, two of which were developed using innovative PROTAC technology. The results presented in this thesis highlight a previously unrecognized interaction between PML and NLRP3, that significantly impacts neuroinflammatory signaling. Importantly, preliminary data also indicate that tested small compounds attenuate NLRP3-mediated responses. Collectively, these findings expand our understanding of the extranuclear functions of PML and provide novel insights into NLRP3 inflammasome regulation, with possible implications for the development of targeted therapies in MS and related disorders.
New Pharmacological Approaches to Reduce PML-Mediated Neuroinflammation in Multiple Sclerosis
RIGHES, GIULIO
2026
Abstract
La proteina della leucemia promielocitica (PML) è un noto oncosoppressore, storicamente descritta come una proteina nucleare. Studi recenti hanno rivelato che PML è localizzata anche in compartimenti extra-nucleari, in particolare a livello delle membrane associate ai mitocondri (MAMs), siti di contatto specializzati tra reticolo endoplasmatico (RE) e mitocondri. In questa sede, PML regola diversi processi fondamentali, tra cui morte cellulare, autofagia e trasferimento del calcio dal RE ai mitocondri. Questa tesi di dottorato esplora un ruolo aggiuntivo e meno caratterizzato di PML nelle MAMs: la regolazione delle risposte immunitarie durante processi neuroinfiammatori, con particolare attenzione all’attivazione dell’inflammasoma NLRP3. L’ipotesi centrale è che l’assenza o la mutazione di PML esasperino l’attivazione immunitaria, contribuendo così all’insorgenza e alla progressione delle malattie neurodegenerative, in particolare della sclerosi multipla. Analizzando l’asse PML–NLRP3, questo lavoro mira non solo a chiarire le basi meccanicistiche della regolazione dell’inflammasoma NLRP3, ma anche a identificare potenziali strategie terapeutiche mirate a questo pathway. L’approccio sperimentale ha utilizzato colture primarie di glia mista, ottenute dalle cortecce di topi wildtype (PML+/+) e PML-/-. Dopo l’ottimizzazione dei protocolli di trattamento e stimolazione mediante saggi di vitalità cellulare, diverse tecniche — tra cui Western blotting, immunofluorescenza ed immunodosaggi — sono state impiegate per valutare le differenze nell’attivazione di NLRP3 tra i due genotipi. Successivamente, le cellule sono state trattate con un pannello di cinque nuovi inibitori dell’inflammasoma NLRP3, due dei quali sviluppati utilizzando una tecnologia PROTAC innovativa. I risultati presentati in questa tesi evidenziano un’interazione precedentemente non riconosciuta tra PML e NLRP3, che influenza in modo significativo la segnalazione neuroinfiammatoria. Parallelamente, dati preliminari indicano che i composti testati attenuano le risposte mediate da NLRP3. Complessivamente, questi risultati ampliano la nostra comprensione delle funzioni extra-nucleari di PML e forniscono nuove intuizioni sulla regolazione dell’inflammasoma NLRP3, con possibili implicazioni per lo sviluppo di terapie mirate nella sclerosi multipla e in disturbi correlati.I documenti in SFERA sono protetti da copyright e tutti i diritti sono riservati, salvo diversa indicazione.
