L’emostasi è un processo fisiologico altamente conservato, essenziale per mantenere la fluidità del sangue e prevenire la perdita ematica mediante la formazione di un coagulo di fibrina stabile, che dipende dall'interazione tra endotelio vascolare, piastrine, fattore von Willebrand (vWF) e fattori della coagulazione (1,2). Le carenze dei fattori VIII (FVIII) o IX (FIX), responsabili rispettivamente dell’emofilia A (HA) e dell’emofilia B (HB), compromettono questo equilibrio e determinano una predisposizione cronica al sanguinamento (3,4). Sebbene la terapia sostitutiva con concentrati di fattori della coagulazione rappresenti il trattamento di riferimento, permangono importanti limitazioni quali la breve emivita plasmatica, la necessità di infusioni frequenti e lo sviluppo di alloanticorpi neutralizzanti (inibitori) (5,6). Questa tesi esplora due strategie distinte di ingegneria proteica per affrontare tali sfide terapeutiche: i) lo sviluppo di una variante di FIX a emivita prolungata (EHL) per pazienti senza inibitori e ii) la progettazione di un nuovo agente di bypass per pazienti con inibitori. Nel primo progetto è stato generato un pannello di varianti iperattive di FIX-Padua (R338L) fuse a una variante di albumina umana ingegnerizzata (HSAQMP) con maggiore affinità per il recettore neonatale Fc (FcRn). Le proteine di fusione sono state ulteriormente modificate in posizione K5 nel dominio Gla del FIX per modulare l’affinità per il collagene di tipo IV (Col4). La caratterizzazione in vitro ha confermato l’attività coagulante e il corretto processamento proteolitico, oltre a una superiore interazione con FcRn. Gli studi farmacocinetici in modelli murini (Tg32, Balb/c e F9 KO) hanno dimostrato che la variante HSAQMP prolunga l’emivita plasmatica grazie a un riciclo più efficiente mediato da FcRn. Nei topi HB, la variante dotata di maggiore affinità per il Col4, ha mostrato un’emivita più lunga, maggiore accumulo nei tessuti ricchi di Col4 e un’efficacia emostatica persistente fino a 96 ore dopo una singola somministrazione. Questi dati evidenziano il ruolo chiave dell’accumulo extravascolare del FIX nel prolungare la sua funzione in vivo. Nel secondo progetto è stato ideato un nuovo agente di bypass basato sul fattore X (FX), ingegnerizzato a livello del suo peptide di attivazione con sequenze derivate dal FIX, per consentire l’attivazione diretta da parte del FXIa conservando l’attivazione attraverso le vie fisiologiche. Le varianti principali, FXBP4b e FXBP4c, espresse e purificate da cellule umane, sono state attivate efficacemente da FXIa pur conservando la capacità di essere attivate da FVIIa/TF e FIXa. In plasmi carenti di FVIII o FIX, entrambe le varianti hanno normalizzato i tempi di coagulazione e ripristinato la generazione di trombina in modo dose-dipendente, confermandone l’efficacia come agenti di bypass. In particolare, FXBP4b ha significativamente abbreviato i tempi di coagulazione in campioni di plasma di pazienti con HA e HB ad alto titolo di inibitori, mostrando attività paragonabili agli agenti di bypass attualmente disponibili. Ciò ne evidenzia il potenziale come agente universale, in presenza o assenza di inibitori. Nel complesso, questi risultati dimostrano il potenziale dell’ingegneria proteica nel migliorare la funzione dei fattori della coagulazione attraverso la modulazione di specifiche interazioni molecolari, come il legame FIX–Col4 per la biodistribuzione e la modifica del peptide di attivazione del FX per un controllo mirato dell’attività. Le strategie descritte rappresentano un passo verso la prossima generazione di terapie emostatiche di precisione, con l’obiettivo di aumentare l’efficacia della terapia sostitutiva e sviluppare approcci di bypass più sicuri e controllabili per i pazienti con inibitori. Gli studi futuri saranno dedicati alla validazione in vivo e all’ottimizzazione farmacocinetica di queste varianti innovative.
Hemostasis is a tightly regulated physiological process that preserves blood fluidity and prevents bleeding through the formation of a stable fibrin clot, involving a dynamic interplay between the endothelium, platelets, von Willebrand factor (vWF), and coagulation factors (1,2). Deficiencies in factors VIII (FVIII) or IX (FIX), responsible for hemophilia A (HA) and B (HB), disrupt this balance and cause lifelong bleeding tendencies (3,4). Although replacement therapy with recombinant clotting factors remains the cornerstone of care, challenges such as short plasma half-life, frequent intravenous infusions, and the development of neutralizing alloantibodies (inhibitors) persist (5,6). This thesis explores two distinct protein engineering strategies to address unmet needs in hemophilia therapy: i) the development of extended half-life (EHL) FIX variants for non-inhibitor patients, and ii) the generation of a novel bypassing agent (BPA) for inhibitor patients. In the first project, a panel of hyperactive FIX-Padua (R338L) variants was engineered by fusion to an albumin variant (HSAQMP) with enhanced neonatal Fc receptor (FcRn) binding. Additional substitutions at residue K5 (K5R or K5A) in the FIX Gla domain were introduced to fine-tune affinity for collagen IV (Col4). In vitro studies confirmed preserved coagulant activity, efficient linker cleavage, and improved FcRn binding. Pharmacokinetic analyses in several mouse models (Tg32, Balb/c, and F9 KO) revealed that HSAQMP-fusion extended plasma half-life through enhanced FcRn-mediated recycling. Notably, in the HB model, the K5R variant—displaying higher Col4 affinity—showed markedly prolonged half-life, increased accumulation in Col4-rich tissues, and sustained hemostatic efficacy up to 96 hours after a single dose. These findings emphasize the key contribution of extravascular sequestration to FIX functional persistence. The second project focused on the design of a novel FX-based BPA by engineering the FX activation peptide to enable direct activation by FXIa while preserving activation through intrinsic and extrinsic pathways. The leading variants, FXBP4b and FXBP4c, were expressed in human cells and purified to homogeneity. Both were efficiently activated by FXIa and retained activation by FVIIa/TF and FIXa. In FVIII- and FIX-deficient plasmas, the variants normalized clotting times and restored thrombin generation in a dose-dependent manner, confirming their bypassing activity. Importantly, FXBP4b markedly shortened clotting times in plasma samples from HA and HB patients with high-titer inhibitors, performing comparably to current BPAs. This identifies FXBP4b as a promising universal bypassing agent resistant to circulating inhibitors. Together, these studies demonstrate the power of protein engineering to rationally modulate coagulation factor behavior by targeting molecular determinants such as FIX–Col4 binding and FX activation control. The FIX-HSAQMP variants illustrate how extravascular interactions can dictate in vivo persistence, whereas the FXBP4b variant provides proof of concept for a controllable, multi-pathway activatable bypassing agent. Overall, these findings pave the way for the next generation of precision hemostatic therapies with improved efficacy and safety for both inhibitor and non-inhibitor patients. Future efforts will aim to refine pharmacokinetics and assess in vivo efficacy in preclinical hemophilia models.
Rational protein engineering strategies for the development of novel therapeutics in Hemophilia
TARANTINO, REBECCA
2026
Abstract
L’emostasi è un processo fisiologico altamente conservato, essenziale per mantenere la fluidità del sangue e prevenire la perdita ematica mediante la formazione di un coagulo di fibrina stabile, che dipende dall'interazione tra endotelio vascolare, piastrine, fattore von Willebrand (vWF) e fattori della coagulazione (1,2). Le carenze dei fattori VIII (FVIII) o IX (FIX), responsabili rispettivamente dell’emofilia A (HA) e dell’emofilia B (HB), compromettono questo equilibrio e determinano una predisposizione cronica al sanguinamento (3,4). Sebbene la terapia sostitutiva con concentrati di fattori della coagulazione rappresenti il trattamento di riferimento, permangono importanti limitazioni quali la breve emivita plasmatica, la necessità di infusioni frequenti e lo sviluppo di alloanticorpi neutralizzanti (inibitori) (5,6). Questa tesi esplora due strategie distinte di ingegneria proteica per affrontare tali sfide terapeutiche: i) lo sviluppo di una variante di FIX a emivita prolungata (EHL) per pazienti senza inibitori e ii) la progettazione di un nuovo agente di bypass per pazienti con inibitori. Nel primo progetto è stato generato un pannello di varianti iperattive di FIX-Padua (R338L) fuse a una variante di albumina umana ingegnerizzata (HSAQMP) con maggiore affinità per il recettore neonatale Fc (FcRn). Le proteine di fusione sono state ulteriormente modificate in posizione K5 nel dominio Gla del FIX per modulare l’affinità per il collagene di tipo IV (Col4). La caratterizzazione in vitro ha confermato l’attività coagulante e il corretto processamento proteolitico, oltre a una superiore interazione con FcRn. Gli studi farmacocinetici in modelli murini (Tg32, Balb/c e F9 KO) hanno dimostrato che la variante HSAQMP prolunga l’emivita plasmatica grazie a un riciclo più efficiente mediato da FcRn. Nei topi HB, la variante dotata di maggiore affinità per il Col4, ha mostrato un’emivita più lunga, maggiore accumulo nei tessuti ricchi di Col4 e un’efficacia emostatica persistente fino a 96 ore dopo una singola somministrazione. Questi dati evidenziano il ruolo chiave dell’accumulo extravascolare del FIX nel prolungare la sua funzione in vivo. Nel secondo progetto è stato ideato un nuovo agente di bypass basato sul fattore X (FX), ingegnerizzato a livello del suo peptide di attivazione con sequenze derivate dal FIX, per consentire l’attivazione diretta da parte del FXIa conservando l’attivazione attraverso le vie fisiologiche. Le varianti principali, FXBP4b e FXBP4c, espresse e purificate da cellule umane, sono state attivate efficacemente da FXIa pur conservando la capacità di essere attivate da FVIIa/TF e FIXa. In plasmi carenti di FVIII o FIX, entrambe le varianti hanno normalizzato i tempi di coagulazione e ripristinato la generazione di trombina in modo dose-dipendente, confermandone l’efficacia come agenti di bypass. In particolare, FXBP4b ha significativamente abbreviato i tempi di coagulazione in campioni di plasma di pazienti con HA e HB ad alto titolo di inibitori, mostrando attività paragonabili agli agenti di bypass attualmente disponibili. Ciò ne evidenzia il potenziale come agente universale, in presenza o assenza di inibitori. Nel complesso, questi risultati dimostrano il potenziale dell’ingegneria proteica nel migliorare la funzione dei fattori della coagulazione attraverso la modulazione di specifiche interazioni molecolari, come il legame FIX–Col4 per la biodistribuzione e la modifica del peptide di attivazione del FX per un controllo mirato dell’attività. Le strategie descritte rappresentano un passo verso la prossima generazione di terapie emostatiche di precisione, con l’obiettivo di aumentare l’efficacia della terapia sostitutiva e sviluppare approcci di bypass più sicuri e controllabili per i pazienti con inibitori. Gli studi futuri saranno dedicati alla validazione in vivo e all’ottimizzazione farmacocinetica di queste varianti innovative.I documenti in SFERA sono protetti da copyright e tutti i diritti sono riservati, salvo diversa indicazione.
