Spatial RNA-mapping reveals the unique patterns of expression and localisation of dystrophin isoforms in the human adult normal brain to improve understanding of brain involvement in muscular dystrophy.

Introduzione. La distrofia muscolare di Duchenne (DMD) è una malattia neuromuscolare legata al cromosoma X, dovuta a mutazioni nel gene distrofina (DMD) che causano l'assenza della proteina distrofina. La distrofina svolge le sue funzioni non solo a livello muscolare, ma la sua presenza è rilevante anche per la regolazione di diversi circuiti cerebrali e durante lo sviluppo del sistema nervoso centrale. È stato riportato che mutazioni localizzate nella regione distale del gene DMD, alterando l’espressione sia delle isoforme lunghe (Dp427) sia di quelle corte come la Dp140 e la Dp71, influenzano il fenotipo neurocognitivo e neurocomportamentale dei pazienti DMD. Scopo. L’obiettivo di questo lavoro è stato quello di valutare l’espressione e la localizzazione delle isoforme del gene DMD in diverse aree del cervello umano adulto di controllo. Metodi. Tutte le isoforme DMD sono state inizialmente analizzate in 24 principali aree del cervello umano adulto, rappresentate nel TissueScan cDNA array, utilizzando la TaqMan Real-time PCR. Le aree con i più alti livelli di espressione delle isoforme DMD sono state prioritizzate per la successiva analisi di ibridazione in situ Basescope, usando sonde specifiche per il riconoscimento delle singole isoforme DMD. L’analisi Basescope è stata effettuata su diverse aree di cervello provenienti da 8 donatori maschi adulti, ottenute dalla biobanca di Edimburgo. In particolare, abbiamo analizzato tessuti fissati in formalina e inclusi in paraffina (FFPE) di: cervelletto, vermis, nucleo dentato, giro paracentrale, corpo calloso, giro cingolato, ippocampo, amigdala e substantia nigra. Risultati. Uno screening preliminare tramite Real-time PCR ha dimostrato che le isoforme più rappresentate nelle aree cerebrali studiate sono la Dp427b, Dp427m, Dp427p2, Dp140, Dp71 e Dp40. L’analisi BaseScope ha poi mostrato che queste isoforme sono trascritte in tutte le aree cerebrali testate, in quantità diversa sia tra i donatori sia tra le diverse regioni. Sono stati identificati tre principali clusters di espressione: i) livello basso, rappresentato dalle isoforme Dp427m e Dp427p2; ii) livello medio, comprendente le isoforme Dp140, Dp71 e Dp40, principalmente localizzate nel cervelletto e nell'amigdala; iii) livello alto, riferito alla Dp427b, isoforma maggiormente espressa nell'ippocampo. Il corpo calloso, la substantia nigra, il nucleo dentato e il vermis sono risultate le aree con la più bassa rappresentazione delle isoforme DMD. La valutazione della localizzazione dei trascritti DMD in specifiche sub-aree presenti all’interno di alcune regioni ha evidenziato la presenza di uno specifico pattern di localizzazione nelle sub-aree del cervelletto, vermis, giro paracentrale e ippocampo. Conclusioni. In questo lavoro abbiamo definito l’espressione e la localizzazione delle isoforme DMD nel cervello adulto umano di controllo. L'arricchimento della Dp427b in alcune aree appartenenti al sistema limbico (ippocampo, amigdala e giro cingolato), della Dp140 nel cervelletto e della Dp71 nell'ippocampo, amigdala e cervelletto, sono in linea con le comorbidità neurologiche osservate negli individui affetti da DMD. L'identificazione di una mappa di espressione e localizzazione dei trascritti delle isoforme della distrofina nel cervello umano adulto di controllo potrà contribuire ad associare alcuni fenotipi neurologici con specifici meccanismi molecolari non solo nella DMD ma anche in altre patologie con presenza di problematiche neurocognitive e neurocomportamentali.

ABSTRACT (English) Background. Duchenne muscular dystrophy (DMD) is an X-linked neuromuscular disease due to pathogenic variants in the DMD gene causing the absence of dystrophin protein. Dystrophin function is not only limited to muscle but is also relevant in several brain circuits and during brain development. Pathogenic variations occurring in the 3’ of the gene, and thus disrupting both full-length (Dp427) and short 3’ isoforms as Dp140 and Dp71, are known to impact on the neurocognitive and neurobehavioral phenotypes. Aim. We intended to assess the topography of DMD isoforms in relationship to the known brain comorbidities in human adult normal brain areas. Methods. All dystrophin isoforms were firstly analysed in 24 adult human brain areas using TaqMan Real-time PCR on TissueScan cDNA array. The areas showing the highest levels of DMD isoforms were prioritised for Basescope RNA in situ hybridisation analysis with probes designed to detect each selected DMD isoform. This latter technique was used in samples from 8 human adult normal male donor brains obtained from the Edinburgh Brain-Tissue Bank. We analysed formalin fixed paraffin embedded (FFPE) tissues from the cerebellum, vermis, dentate nucleus, paracentral gyrus, corpus callosum, cingulate gyrus, hippocampus, amygdala, and substantia nigra. Results. The most represented isoforms in studied brain areas were Dp427b, Dp427m, Dp427p2, Dp140, Dp71 and Dp40, based on a preliminary Real-time PCR screening. BaseScope showed that these isoforms were transcribed in all brain areas with a different abundance between donors and also between brain areas. Three main DMD isoform clusters were identified, including i) low represented, as Dp427m and Dp427p2, ii) medium represented, as Dp140, Dp71, and Dp40, which are mainly localised in the cerebellum and amygdala, and iii) highly represented, as Dp427b which is enriched in the hippocampus. The corpus callosum, substantia nigra, nucleus dentate, and vermis were the areas with the lowest isoform representation. We could also recognize isoforms with cell-layer specific localisation in the cerebellum, vermis, paracentral gyrus, and hippocampus. Conclusion. We defined spatial and topographic representation of DMD isoforms in human normal adult brain. The enrichment in Dp427b in some areas belonging to the limbic system (hippocampus, amygdala, and cingulate gyrus), Dp140 in the cerebellum, and Dp71 in the hippocampus, amygdala, and cerebellum are well aligned with the brain phenotypes observed in individuals affected by DMD. The identification of a spatial RNA-mapping of dystrophin isoforms into human normal adult brain may help associate some clinical brain comorbidities with specific molecular mechanisms in DMD/BMD and in other conditions with associated neurocognitive and neurobehavioral phenotypes.