CAD204520 targets NOTCH1 PEST domain mutations in lymphoproliferative disorders

Le mutazioni nel dominio PEST di NOTCH1 sono spesso descritte nelle neoplasie ematopoietiche e svolgono un ruolo chiave nei tumori linfoproliferativi potenziando la segnalazione di Notch1 e, di conseguenza, promuovendo la proliferazione, la sopravvivenza e la migrazione cellulare. Queste mutazioni identificano un sottogruppo di malattie linfoproliferative con prognosi sfavorevole; ad esempio, la leucemia linfocitica cronica (CLL) e il linfoma mantellare (MCL) con mutazioni nel dominio PEST di NOTCH1 sono rispettivamente associati ad una aumentata possibilità di incorrere in trasformazione di Richter (RT) e a una sopravvivenza complessiva più breve. Nonostante diversi sforzi terapeutici, come lo sviluppo di diversi potenziali inibitori di Notch1 e anticorpi monoclonali, attualmente non esistono trattamenti specifici per le malattie con segnalazione Notch1 aberrante, suggerendo la necessità di colmare questa lacuna terapeutica. Attualmente, sono in fase di sviluppo diversi inibitori di NOTCH1 e tra questi, il nostro gruppo ha scoperto e ottimizzato un nuovo derivato benzimidazolico, CAD204520, un inibitore specifico della Sarco-Endoplasmic Reticulum Ca2+-ATPase (SERCA). CAD204520 ha mostrato un effetto selettivo al traffico di Notch1 mutato e un'attività antitumorale in modelli di cancro caratterizzati da mutazione NOTCH1 rispetto a quelli wild type (WT). Pertanto, l'obiettivo di questo lavoro è stato indagare le proprietà anti-Notch1 di CAD204520 nelle neoplasie linfoproliferative caratterizzate da mutazioni nel dominio PEST di NOTCH1. Per fare ciò, abbiamo raccolto caratteristiche cliniche, citogenetiche e genomiche di una coorte di 37 pazienti con CLL e abbiamo osservato che il 16% dei casi, in linea con studi precedenti, mostrava una mutazione nel dominio PEST di NOTCH1. Abbiamo valutato pre-clinicamente l'attività di CAD204520 in campioni primari di CLL e in modelli di linee cellulari di MCL, confermando che le mutazioni nel dominio PEST di NOTCH1 rendono le cellule sensibili all'attività antileucemica mediata da CAD204520. Abbiamo ulteriormente indagato l'attività antitumorale selettiva di CAD204520 in modelli con mutazioni nel dominio PEST in un contesto in vitro e in vivo, attraverso un saggio di co-coltura e in un modello di xenotrapianto sottocutaneo con un doppio innesto simultaneo di linee cellulari di MCL con e senza mutazioni di NOTCH1. CAD204520 ha inibito la proliferazione cellulare, indotto l'apoptosi e ridotto i volumi tumorali nelle neoplasie in cui NOTCH1 è mutato. Inoltre, al fine di aumentare il potenziale terapeutico del trattamento più recente nelle malattie linfoproliferative, abbiamo incluso CAD204520 in combinazione con ibrutinib, un inibitore della Bruton tyrosine kinase (BTK), e venetoclax, un inibitore della proteina B-cell lymphoma-2 (BCL-2). CAD204520 ha potenziato l'effetto sinergico di questo trattamento in campioni con mutazioni nel dominio PEST di NOTCH1, sostenendo così un ruolo dell'inibizione di Notch in questi tumori. In conclusione, il nostro lavoro fornisce un forte supporto allo sviluppo di CAD204520 come nuovo approccio terapeutico nelle patologie linfoproliferative croniche caratterizzate da mutazioni nel dominio PEST. Inoltre, supporta lo sviluppo di nuove strategie per potenziare l'effetto delle combinazioni di trattamenti sinergici, come venetoclax-ibrutinib, in pazienti che rientrano in questo sottogruppo aggressivo di malattia.

NOTCH1 PEST domain mutations are often described in hematopoietic malignancies and play a key role in lymphoproliferative tumors by enhancing Notch1 signaling and, consequently, promoting cells proliferation, survival, and migration. These mutations identify a worse prognostic subset of lymphoproliferative diseases, for example NOTCH1 PEST mutated chronic lymphocytic leukemia (CLL) and mantle cell lymphoma (MCL) are associated with a potential increase of Richter transformation and a shorter overall survival, respectively. Despite several therapeutic efforts, such as the development of different potential Notch1 inhibitors and monoclonal antibodies, currently there are no specific treatment for diseases with aberrant Notch signaling, suggesting the need to fill this therapeutic gap. Currently, several NOTCH1 inhibitors are in development and among these, our group discovered and optimized a new benzimidazole derivative, CAD204520, a specific inhibitor of the Sarco-Endoplasmic Reticulum Ca2+-ATPase (SERCA). CAD204520 showed a selective impairment of Notch1 mutated trafficking and an anti-tumor activity in NOTCH1 mutated cancer models compared to the wild-type (WT) ones. So, the aim of this work was to investigate the selective anti-Notch1 properties of CAD204520 in lymphoproliferative malignancies characterized by NOTCH1 PEST mutations. For this purpose, we collected clinical, cytogenetic, and genomic features of a cohort of 37 CLL patients and we observed that the 16% of cases, in line with previous reports, showed a NOTCH1 PEST domain mutation. We preclinically assessed the activity of CAD204520 in CLL primary samples and MCL cell line models, confirming that NOTCH1 PEST domain mutations sensitize cells to the anti-leukemic activity mediated by CAD204520. We further investigated the selective anti-tumor activity of CAD204520 in NOTCH1 PEST mutated models in an in vitro and in vivo setting, through a co-culture assay, and in a subcutaneous xenograft model with a simultaneous double engraftment of MCL cell lines with and without NOTCH1 mutations. CAD204520 inhibited cells proliferation, induced apoptosis, and reduced tumor volumes in neoplasms where NOTCH1 was mutated. Moreover, in order to increase the therapeutic potential of the most novel target treatment combination in lymphoproliferative diseases, we included CAD204520 in the combination with ibrutinib, an inhibitor of the Bruton tyrosine kinase (BTK), and venetoclax, an inhibitor of B-cell lymphoma-2 protein (BCL-2). CAD204520 enhanced the synergistic effect of this treatment regimen in samples harboring the NOTCH1 PEST domain mutations, thus supporting a role for Notch1 inhibition in these tumors. In conclusion, our work provides a strong support for the development of CAD204520 as a novel therapeutic approach in chronic lymphoproliferative disorders characterized by PEST domain mutations. Furthermore, it supports the development of novel strategies, enhancing the effect of combination treatment, such as venetoclax-ibrutinib, in this aggressive subset of patients.