Design, synthesis, and purification of biopharmaceuticals, included highly modified oligonucleotides.

Riassunto tesi dottorato, Lorenzo Preti Questo lavoro di tesi si concentra sulla bioconiugazione, riflettendo sugli argomenti affrontati durante i miei studi di dottorato. La tesi è strutturata in due sezioni principali: coniugati di piccole molecole e coniugati di oligonucleotidi. Ogni sezione inizia con un'introduzione completa ai principi, alle metodologie e alle applicazioni dei rispettivi bioconiugati, supportata da pertinenti esempi della letteratura. Inoltre, viene fornita un'introduzione generale alla chimica dei bioconiugati, comprendente una discussione sulla click chemistry, in particolare sulle cicloaddizioni azide-alchino catalizzate da rame e rutenio e sui loro meccanismi. La prima sezione riguarda la sintesi di coniugati di piccole molecole, in particolare quelli tra acidi biliari e molecole farmacologicamente attive come paclitaxel e diidroartemisinina. Si inizia con una panoramica sulle origini, le strutture e le attività degli acidi biliari, seguita da un riassunto della letteratura riguardo all'utilizzo degli acidi biliari nella bioconiugazione. Un capitolo dettaglia la sintesi di coniugati tra paclitaxel, acido ursodeossicolico e acido chenodeossicolico, comprese le modifiche con pacific blue, un fluoroforo a base di cumarina, per studi biologici. Questa ricerca, in collaborazione con altri gruppi, ha confermato un miglioramento dell'assorbimento cellulare dei coniugati di acidi biliari rispetto al solo paclitaxel.1 Un altro capitolo discute la sintesi di bioconiugati di diidroartemisinina-acidi biliari, alcuni dei quali hanno mostrato un'attività antivirale promettente contro il virus SARS-CoV-2 nei primi test biologici. Questo ha spinto alla sintesi su scala più ampia e ad ulteriori studi di correlazione struttura-attività. La seconda sezione si concentra sulla sintesi, purificazione e caratterizzazione di coniugati di oligonucleotidi. Si inizia con un'introduzione alle metodologie comunemente utilizzate per la sintesi e la purificazione degli oligonucleotidi, nonché una panoramica dello strumento oligosintetizzatore. Un capitolo descrive la sintesi di un oligonucleotide coniugato all'acido ursodeossicolico tramite vari linker, mirato a investigare l'influenza del linker sull'efficacia di exon-skipping. Il secondo capitolo discute la sintesi, la purificazione e la funzionalizzazione di oligonucleotidi con fluorofori sensibili alla legatura per lo studio delle loro capacità di discriminazione dei mismatch e il miglioramento dell'assorbimento cellulare. Questo lavoro, condotto durante un periodo di scambio presso il gruppo del Professor Tom Brown a Oxford, include studi di annealing di DNA-RNA attraverso temperature di fusione e proprietà di fluorescenza. La tesi comprende sia dati pubblicati che inediti, contribuendo alla comprensione dei principi e delle applicazioni della bioconiugazione in vari campi. 1. Melloni, E. et al. Synthesis and Biological Investigation of Bile Acid-Paclitaxel Hybrids. Molecules 27, 471 (2022).

Thesis Abstract Lorenzo Preti This thesis work is focused on bioconjugation and reflects the topics on which I worked during my PhD. The thesis is divided into two main sections: small molecules conjugates and oligonucleotide conjugates. Both sections are preceded by a general introduction on the respective bioconjugate principles, methodologies and applications with literature examples. Moreover, a general introduction on bioconjugate chemistry is given. Here, is also introduced the concept of click chemistry with focus on the copper and ruthenium catalysed azide alkyne cycloadditions and their mechanisms. The first section regards the synthesis of small molecular conjugates; between bile acids and pharmaceutically active molecules such as paclitaxel and dihydroartemisinin. In this section introduction, the origins, structure, and activities of bile acids are described. Furthermore, their use in bioconjugation in literature is reviewed. One chapter is represented by the work undertook for the synthesis of conjugates between paclitaxel, ursodeoxycholic acid and chenodeoxycholic acid. In this work, published in 2022,1 is also reported the synthesis of the same conjugates modified with pacific blue, a coumarin based fluorophore, necessary for biological studies. The studies, in collaboration with another research group confirmed the initial hypothesis of a better cell uptake of the bile acids conjugates in respect to paclitaxel alone. The other chapter is about the synthetic work necessary to obtain a small number of bioconjugates of dihydroartemisinin, paramount antimalarial drug with other interesting properties, and bile acids. In this work, initial biological testing against SARS-CoV-2 virus helped to identify a conjugate, precedently synthetized by our group, able to inhibit the viral replication in vitro. This prompted us to improve the synthetic route toward the conjugate, arriving at gram scale production. We expanded the plethora of similar compounds envisaging a structure activity relationship study. The synthetic work as well as the biological results are still unpublished, although a part of it has been submitted. The second section of the thesis is concerned with the synthesis, purification, and characterization of oligonucleotide conjugates. This section starts with an introduction of the methodologies commonly employed for oligonucleotide synthesis and purification, and a description of the oligo synthesizer instrument. The first chapter describes the synthesis of an oligonucleotide conjugated to ursodeoxycholic acid trough different linkers. This work envisages the study of the linker influence on the exon skipping efficacy of the conjugate in the context of understanding the relationship between oligonucleotide modification and efficacy. The work takes advantage of a recent publication on Duchenne muscular dystrophy by our group. The linkers were chosen based on their commercial availability, length and lipophilicity, seeking an improvement in exon skipping efficacy. The second chapter is built on the work undertook during the exchange period in Professor Tom Brown’s group (Oxford, UK). It consists of the synthesis, purification and click labelling of oligonucleotides with binding sensitive fluorophores for the investigation of their mismatch discriminating abilities and improvement of the cellular uptake of oligonucleotides. The work started with a locked ribose modified uridine, proceeded with oligonucleotide synthesis, and click labelling and culminated in binding studies through melting temperatures and fluorescence properties. Further expansion of the project into delivery of modified sequences in cells is envisaged. All this section work is still unpublished. 1. Melloni, E. et al. Synthesis and Biological Investigation of Bile Acid-Paclitaxel Hybrids. Molecules 27, 471 (2022).