NEET Proteins: from Electronic Properties to Ligand Binding and Design

Le proteine NEET umane consistono di tre proteine redox ferro-zolfo: mitoNEET (mNT), NAF-1 e MiNT. Sono localizzate nei mitocondri, nel reticolo endoplasmatico e nella membrana associata ai mitocondri. mNT e NAF-1 sono omodimeri. Le due subunità contiengono un cluster [2Fe–2S] caratterizzato da una coordinazione 3Cys:1His. MiNT è un monomero contenente due di questi cluster. I cluster possono essere rilasciati/trasferiti a proteine in vitro. Esistono in uno stato ossidato, contenente due ioni ferrici, e in uno stato ridotto, con uno ione Fe(II) e uno ione Fe(III). Le protein NEET sono recentemente emerse come importanti bersagli per varie malattie, incluse malattie neurodegenerative e il cancro. Purtroppo, però, finora non è stato sviluppato alcun farmaco che lega alle proteine NEET umane. Nella mia tesi, ho utilizzato una strategia in silico a più fasi per studiare questi importanti sistemi e sviluppare nuovi ligandi. In primo luogo, ho caratterizzato la struttura elettronica del cluster in entrambi gli stati redox della proteina mediante calcoli da principi primi. Questi mostrano che, al momento della riduzione, solo lo ione metallico vicino alla superficie della proteina si riduce, consistenemente con dati sperimentali. I miei calcoli, insieme agli esperimenti in vitro, hanno inoltre dimostrato che lo stato ridotto del cluster [2Fe–2S] delle proteine NEET umane è cineticamente inerte. Inoltre, sfruttando questi calcoli, ho sviluppato un campo di forza per entrambi gli stati redox di questa importante classe di proteine, consentendo finalmente di progettare farmaci basati sulla simulazione molecolare su queste proteine. Inoltre, queste simulazioni molecolari hanno permesso di prevedere, per la prima volta, la posizione di legame di un ligando (2-benzamido-4-(1,2,3,4-tetraidronaftalen-2-il)-tiofene-3-carbossilato, formula chimica: [C22H19NO3S], A) sulle proteine NEET in soluzione acquosa. I calcoli sono consistenti con dati di affinità misurati sperimentalmente. Infine, per identificare nuovi ligandi è stato eseguito uno screening virtuale con più modelli di farmacofori. La potenza di questi ultimi potrebbe essere testata in laboratorio nel tentativo di trovare leganti più efficienti di quelli identificati finora.

The human NEET proteins consist of three iron-sulfur redox proteins, namely mitoNEET (mNT), NAF-1 and MiNT. They are located on mitochondria, endoplasmic reticulum, and mitochondria-associated membrane. mNT and NAF-1 are homodimers, each subunit containing a [2Fe–2S] cluster characterized by a 3Cys:1His coordination, while MiNT is a monomer containing two of such clusters. The clusters can be released/transferred to target acceptors in vitro. They exist in an oxidized state, containing two ferric ions, and a reduced state, with an Fe(II) and an Fe(III) ion. These proteins have recently emerged as important targets for a variety of diseases, including neurodegenerative diseases and cancer. Yet, unfortunately, no drug targeting human NEET proteins has been developed so far. Here, I have used a multi-step in silico strategy to investigate these important systems and develop new ligands. First, I have characterized the electronic structure of the cluster in both redox states of the protein by first principles calculations. These show that upon reduction, only the metal ion close to the protein surface gets reduced, consistently with experimental evidence. My calculations, along with in vitro experiments, have further shown that the reduced state of human NEET proteins [2Fe–2S] cluster is kinetically inert. Next, by capitalizing on these calculations, I have developed a force field for both redox states of these important class of proteins, allowing finally one to do molecular-simulation-based drug design on these proteins. In addition, molecular simulations based on the developed force field have allowed predicting, for the first time, the pose of a ligand (2-benzamido-4-(1,2,3,4-tetrahydronaphthalen-2-yl)-thiophene-3-carboxylate, chemical formula: [C22H19NO3S], A) onto the entire proteins in aqueous solution. The calculations are consistent with measured affinity data. Finally, virtual screening with multiple pharmacophore models has been performed to identify new ligands. The potency of the latter could be tested now in the lab in an attempt at finding ligands targeting human NEET proteins more efficient than those identified so far.