SEX DETERMINANT IN AGING AND OSTEOARTHRITIS: IN VITRO MODELS OF HUMAN CHONDROCYTES AND SYNOVIOCYTES AND IN VIVO EVALUATIONS

L'osteoartrite (OA) è una delle malattie muscoloscheletriche degenerative più comuni, caratterizzata principalmente da progressiva distruzione della cartilagine articolare, infiammazione della membrana sinoviale e deformità ossea, che porta a dolore e disabilità. L'OA è una patologia complessa con un'eziologia poco chiara e molteplici fattori di rischio, tra cui il sesso e l'invecchiamento. Scopo dello studio è stato quello di valutare il comportamento di due fenotipi cellulari presenti a livello articolare, sinoviociti e condrociti, ed il ruolo delle differenze di sesso in presenza di un microambiente infiammatorio (tipico dell'OA) e/o di stress ossidativo (tipico dell'invecchiamento), utilizzando un modello in vitro bidimensionale (2D) di monocolture e co-colture. Sinoviociti e condrociti umani isolati da pazienti di sesso maschile e femminile con OA del ginocchio, sono stati stimolati per 24 ore con l’interleuchina IL-1β e/o con il perossido d’idrogeno H2O2. Le differenze di sesso delle cellule e l’effetto degli stimoli sono stati valutati attraverso tecniche di biologia cellulare e molecolare, investigando il tasso di proliferazione cellulare, la percentuale di guarigione delle microferite (ovvero la migrazione cellulare), l’espressione genica di molecole pro-infiammatorie (IL-6), enzimi proteolitici (ADAMTS-4, ADAMTS-5, MMP-13), marcatori di senescenza e apoptosi (Klotho, Caspase-3) e componenti della matrice extracellulare (COL2A1). Inoltre, utilizzando un modello in vivo di invecchiamento ed OA spontanea con topi C57BL/6, sono state valuate, attraverso tecniche istologiche e microtomografiche, la presenza di OA e le differenze di sesso nella struttura e morfologia delle componenti articolari (osso, cartilagine articolare, membrane sinoviale) e della colonna vertebrale. I risultati hanno mostrato che le cellule di pazienti di sesso femminile avevano una capacità di risposta peggiore in condizioni sfavorevoli di infiammazione e stress ossidativo rispetto a quelli di pazienti di sesso maschile, con una minore vitalità e migrazione cellulare, e una maggiore espressione di marcatori infiammatori e apoptotici, rilascio di enzimi proteolitici e prodotti di stress ossidativo. Inoltre, lo studio ha evidenziato che l’effetto combinato del microambiente infiammatorio e dello stress ossidativo ha ridotto la vitalità e la migrazione cellulare dei sinoviociti e condrociti. Inoltre, aumenta la produzione di IL-6, Caspase-3, ADAMTS-4, ADAMTS-5, MMP-13 e ROS; mentre diminuisce l'espressione di Klotho e COL2A1. Diversamente, il modello in vivo ha confermato la presenza di OA nei topi anziani senza però mostrare differenze tra i sessi. In conclusione, i dati ottenuti indicano l’esistenza di differenze nel comportamento cellulare associate al sesso nell’OA, suggerendo la rilevanza di ulteriori studi volti ad identificare i meccanismi della patologia OA e le potenziali differenze legate al sesso attraverso adeguati modelli preclinici, per valutare nuove ipotesi, concetti e trattamenti terapeutici in grado di arrestare o invertire la progressione della malattia con un approccio personalizzato.

Osteoarthritis (OA) is one of the most common degenerative musculoskeletal diseases, mainly characterized by progressive destruction of articular cartilage, inflammation of the synovial membrane and bone deformity, leading to pain and disability. OA is a complex disease with an unclear etiology and multiple risk factors, including sex and aging. The aim of the study was to evaluate the behavior of two cell phenotypes present at the joint level, synoviocytes and chondrocytes, and the role of sex differences in the presence of an inflammatory microenvironment (typical of OA) and/or oxidative stress (typical of ageing), using a two-dimensional (2D) in vitro model of monocultures and co-cultures. Human synoviocytes and chondrocytes isolated from male and female knee OA patients were stimulated for 24 hours with interleukin IL-1β and/or hydrogen peroxide H2O2. The sex differences of the cells and the effect of the stimuli were evaluated through cellular and molecular biology techniques, investigating the cellular proliferation rate, the healing percentage of the microwounds (i.e. cell migration), the gene expression of pro-inflammatory molecules (IL-6), proteolytic enzymes (ADAMTS-4, ADAMTS-5, MMP-13), markers of senescence and apoptosis (Klotho, Caspase-3) and components of the extracellular matrix (COL2A1). Furthermore, using an in vivo model of aging and spontaneous OA with C57BL/6 mice, the presence of OA and sex differences in the structure and morphology of the joint components (bone, articular cartilage, synovial membrane) and of the column were evaluated through histological and microtomographic techniques. The results showed that cells from female patients had a worse response capacity under unfavorable conditions of inflammation and oxidative stress than those from male patients, with lower cell viability and migration, and higher expression of inflammatory and apoptotic markers, release of proteolytic enzymes and oxidative stress products. Furthermore, the study showed that the combined effect of the inflammatory microenvironment and oxidative stress reduced the viability and migration of synoviocytes and chondrocytes. Furthermore, it increases the production of IL-6, Caspase-3, ADAMTS-4, ADAMTS-5, MMP-13 and ROS; while it decreases the expression of Klotho and COL2A1. Differently, the in vivo model confirmed the presence of OA in aged mice without showing differences between the sexes. In conclusion, the obtained data indicate the existence of sex-associated differences in cellular behavior in OA, suggesting the relevance of further studies aimed at identifying the mechanisms of OA pathology and potential sex-related differences through adequate preclinical models, to evaluate new hypotheses, concepts and therapeutic treatments able to arrest or reverse the progression of the disease with a personalized approach.