MITOCHONDRIAL PERMEABILITY TRANSITION PORE (mPTP) OPENING INHIBITORS AS POTENTIAL DRUGS FOR THE TREATMENT OF ISCHEMIA REPERFUSION INJURY (IRI): DESIGN, SYNTHESIS AND BIOLOGICAL EVALUATION OF DIFFERENT CLASSES OF SMALL MOLECULES.

Il mitocondrio è un organello che produce ATP attraverso la fosforilazione ossidativa. La sua omeostasi è strettamente controllata e la modifica della permeabilità delle sue membrane è correlata a eventi sia a livello cellulare che sistemico. L'ATP sintasi è l'ultimo enzima coinvolto nell'OXPHOS: sfrutta l'energia elettrochimica per alimentare la sintesi di ATP. È costituito da due subunità, FO e F1. Significativo per questo progetto è il c-ring, che fa parte della subunità FO: è un canale attraverso cui i protoni passano e viene promossa la sintesi (o idrolisi) di ATP. Questo sembra essere coinvolto nella formazione e nella regolazione dell’mPTP, un poro nella membrana mitocondriale interna. La sua apertura rende l'IMM non più selettivamente permeabile, causando il collasso del potenziale di membrana mitocondriale, la deplezione di ATP, la rottura dell'OMM e l'attivazione della cascata apoptotica. Si ritiene quindi che la mPT sia un evento centrale implicato in un'ampia gamma di patologie, tra cui il danno da ischemia da riperfusione (IRI). Lo scopo di questo progetto è stato quello di sintetizzare composti inibitori dell'apertura del poro di transizione di permeabilità mitocondriale. Inizialmente, abbiamo sviluppato piccoli derivati dell'urea con tre funzionalità diverse ma simili (uree, tiouree e carbammati), partendo dal fatto che DCU è in grado di legare il c-ring e di inibire l'apertura della mPTP indotta dal calcio. Questo studio ci ha permesso di capire come accettori o donatori di legami H possano influenzare l'interazione con il bersaglio e anche l'attività delle molecole. Le altre classi di derivati si ispirano al composto naturale Oligomicina A, noto per interagire con l'anello c dell'ATP sintasi e bloccare il flusso di protoni. Abbiamo sintetizzato composti monospiranici diversamente sostituiti. Il nucleo principale del composto naturale di riferimento è stato leggermente modificato, rendendolo più stabile all'inattivazione metabolica, ottenendo un nucleo 1,3,8-triazaspiro[4.5]decan-4-one. Le sintesi sono state associate a studi computazionali, grazie ai quali è stato possibile prevedere le interazioni delle molecole con i residui aminoacidici del c-ring. Grazie a un HTVS, abbiamo anche ipotizzato strutture con un'affinità di legame potenzialmente elevata con l'anello c. Combinando le conoscenze ottenute in precedenza con queste nuove, sono state ottenute diverse molecole, tutte con lo stesso nucleo, al quale sono state apportate modifiche graduali e razionali. Inoltre, sempre ispirandoci alla struttura spiranica dell'Oligomicina A, abbiamo progettato derivati dispiranici con scaffold sia piperidinico che pirrolidinico, funzionalizzati con elementi utili all'interazione (elementi aromatici, gruppo carbonilico, ciclo a cinque atomi, azoto come accettore di legami H), ma con maggiore rigidità e dimensione sterica. Abbiamo anche studiato lo scale up della reazione, che ci ha fornito importanti informazioni sulla dinamica della formazione dei prodotti. La parte finale del progetto ha riguardato le valutazioni biologiche. I test sono stati condotti in due diversi laboratori per verificare il potenziale inibitorio dell'apertura della mPTP delle molecole sia in un modello cardiaco sia in uno renale. Una selezione di composti è stata testata su AC16 nei laboratori del professorPinton (Dip di Scienze Mediche dell'Università di Ferrara) con il saggio della cobaltocalceina. Altri studi sono stati condotti nei laboratori del professor Arcovito (dip di Biochimica applicata, Università cattolica del Sacro Cuore - Roma), testando un'altra selezione di composti con il Mito stress test su RPTEC. Abbiamo inoltre esaminato il profilo biologico dei composti più interessanti e le loro proprietà come agenti cardioprotettivi che prevengono l'apoptosi delle cellule, sia in vitro che ex vivo, in particolare in un modello di IRI cardiaco. Prospettive future sono incentrate su studi in vivo.

Mitochondrion is the intracellular organelle, which produces ATP through oxidative phosphorylation (OXPHOS). Its homeostasis is strictly controlled and permeability modification of its membranes is correlated with events both in cellular and systemic levels. ATP synthase is the latter enzyme involved in the OXPHOS: it makes use of electrochemical energy to power the synthesis of ATP. It is constituted by two subunits, FO and F1. Significant for this project is the c-ring, which is part of the FO subunit and through which protons flows and ATP synthesis (or hydrolysis) is promoted. It appears to be involved in the formation and regulation of mPTP, a pore in the inner mitochondrial membrane (IMM). Its opening makes the IMM not more selectively permeable, causing collapse of the mitochondrial membrane potential, ATP depletion, OMM rupture, activation of apoptotic cascade. So, it is believed that mPT is a central event implicated in a wide range of pathologies, including ischemia reperfusion injury (IRI). The aim of this project was to synthesize compounds which are inhibitors of mitochondrial permeability transition pore opening. Initially, we developed small urea derivatives with three different but similar functionalities (urea, thiourea and carbamates scaffold), starting from the fact that DCU is able to bind the c-ring and to inhibit calciuminduced mPTP opening. This study has allowed us to understand how H-bond acceptor or donor moieties can affect the interaction with the target and the activity of the molecules. The other classes of derivatives take inspiration from natural compound Oligomycin A, that is known to interact with the c-ring of the ATP synthase and block the proton flow. We synthesized various different substituted monospiranic compounds. The main core of the natural reference compound has been slightly modified, making it more stable upon metabolic inactivation, obtaining an 1,3,8-triazaspiro[4.5]decan-4-one core. The syntheses were associated with computational studies, thanks to which it was possible to predict the interactions of the molecules with the aminoacidic residues of the c-ring. Thanks to an HTVS, we also hypothesized structures with a potentially high binding affinity to the c-ring. By combining the knowledge previously obtained with these new insights, several molecules were obtained, all of which have the same core and to which gradual and rational modifications were made. Moreover, inspired again by the spiranic structure of Oligomycin A, we designed dispiranic derivatives with both piperidine and pyrrolidine scaffolds, functionalized with elements useful for interaction (aromatic element, carbonyl group, five-atoms cycle, nitrogen as H-bonds acceptors), but with increased rigidity and steric size. We also studied the scale up of the reaction, that challenged us a lot, but gave us important information about the mechanistic dynamics of product formation. The final part of the project concerned biological evaluations. The tests were conducted in two different laboratories to test the mPTP opening inhibitory potential of the molecules both in a cardiac and in a renal model. A selection of compounds was tested on AC16 cells in the labs of professor Paolo Pinton (dept. of Medical Sciences, University of Ferrara) with the cobalt-calcein assay. Other studies were conducted in the labs of Professor Alessandro Arcovito (sect. of Applied Biochemistry, Università cattolica del Sacro Cuore - Rome), testing another selection of compounds with tests on RPTEC cells. We also examined the biological profile of the most interesting compounds and their properties as cardioprotective agents preventing cells from apoptosis, both in vitro and ex vivo, specifically in a model of cardiac IRI. Future perspectives will be focused on proceeding with the testing in vivo, on pig’s heart subjected to ischemia and then perfused