Functional association between the Microprocessor complex and the Spliceosome in the processing of Splice site Overlapping microRNAs

This experimental work of thesis was performed at the International Centre for Genetic Engi neering and Biotechnology (ICGEB, AREA Science Park, Padriciano, Trieste) in the Human Molecular Genetics Group, under the scientific direction of Prof. Franco Pagani. The project was developed during the 2012-2015 academic years. Spliceosome and Microprocessor complex (MPC) are processing machineries that act and cleave precursor (pre)-mRNA to generate spliced mature transcripts and mature microRNAs (miRNAs), respectively. The presence, on the nascent transcript, of several cis-acting regulatory elements allows the correct recognition of the intron-exon junctions by the spliceosome, while the hairpin sequences that form typical RNA secondary structures are recognized and cleaved by the MPC. I have explored the functional relationship between these two machineries focusing on a peculiar class of miRNAs, the Splice site Overlapping (SO)-miRNAs, whose hairpin secondary structure is juxtaposed to an intron-exon junction. In the first part of my Ph.D. project I worked on the evolutionarily conserved SO-miR-34b, whose hairpin is juxtaposed to an acceptor splice site of a non-coding transcriptional unit. Using a minigene approach, I identified a consensus branch point (BP) located in the hairpin and a purine-rich exonic splicing enhancer (ESE) that are strictly required for the correct selection of the 3’ splice site (ss). Splicing inhibition owing to 3’ss mutation or ESE deletion increases miR-34b expression level. Moreover, depletion of MPC components Drosha and DGCR8 abolishes miR-34b production, improving splicing efficiency, while their overexpression has the opposite effect. Therefore, the processing of 3’ SO-miR-34b is regulated in an antagonistic manner by the spliceosome and the MPC, due to the competition between these two processing machineries on the nascent transcript. To better understand the relationship between splicing and SO-miRNAs on a global basis, I focused on the SF3b1 factor, an essential splicing component of the U2 snRNP complex, frequently mutated in different hematological malignancies like chronic lymphocytic leukemia. I carried out a global analysis of miRNA changes in SF3b1 depleted cells. Small RNA-seq showed that, in comparison to other miRNAs, SO-miRNAs are significantly upregulated in the SF3b1 depleted cells, indicating that splicing has a direct influence on the biosynthesis of SO-miRNAs. To evaluate in a more physiological context the crosstalk between these two machineries, I focused on three SO-miRNAs, miR-936, miR-4260 and miR-711, expressed in keratinocytes. Their host transcripts, the COL17A1, LAMB3 and COL7A1 genes, are expressed in the basal layer of epidermis and are down regulated during calcium-induced keratinocytes differentiation. Quantitative analysis of mRNAs and miRNAs expression levels showed that keratinocyte differentiation is associated to a decreased mRNAs expression and to an increased biosynthesis of the corresponding SO-miRNAs. Exogenous administration of these three miRNAs inhibits keratinocytes proliferation, confirming their contribution to keratinocytes differentiation. Interestingly, both SF3b1 silencing and keratinocyte differentiation did not induce changes in the splicing pattern of corresponding SO-miRNA exons. Analysis of published chromatin RNA sequencing data showed that Drosha depletion leads to extensive transcriptional readthrough downstream the SO-pri-miRNA hairpins, suggesting that the MPC might induce premature transcriptional termination of SO-miRNA transcripts. The competition between the spliceosome and the MPC may represent a novel mechanism to regulate the production of mature mRNAs and miRNAs from a shared precursor RNA tran script. In some cases, SO-miRNAs may function as dead-end processing signals inside genes. The activation of these signals, either by an increase in MPC activity or by a reduction in splicing, might induce the biosynthesis of the SO-miRNA and a concomitant production of shorter transcript that is rapidly degraded.

Lo spliceosoma ed il microprocessore sono complessi molecolari che agiscono sull’RNA nascente (pre-mRNA). Entrambi i complessi tagliano il pre-mRNA per produrre rispettivamente l’RNA messaggero ed il microRNA (miRNA) maturo. Il preciso riconoscimento della giunzione tra introne ed esone da parte dello spliceosoma avviene grazie alla presenza di elementi regolatori dello splicing, che, interagendo con proteine attivatorie o inibitorie, favoriscono la selezione dei corretti siti di splicing. RNA, che formano una struttura secondaria a forcina (pri-miRNA), vengono invece riconosciuti e processati dal complesso del microprocessore. Durante l’attivit`a di ricerca, ho approfondito la relazione tra l’attivita` del microprocessore e dello spliceosoma nel processamento di un particolare gruppo di miRNA, gli SO-miRNA (mi croRNA che si sovrappongo ai siti di splicing), la cui struttura secondaria `e localizzata a livello della giunzione tra introne ed esone. Nella prima fase del mio progetto di ricerca ho focalizzato l’attenzione sullo SO-miR-34b, la cui struttura secondaria, situata a livello della giunzione tra introne 1 ed esone 2 di una unit`a trascrizionale non codificante, contiene al suo interno un sito accettore di splicing (3’ss). L’utilizzo di un sistema di minigeni ha permesso l’identificazione di una sequenza di ramificazione (branch point) localizzata all’interno della struttura secon daria del pri-miRNA e di un enhancer di splicing esonico (ESE) ricco in purine, localizzato nell’esone 2, che risultano essere necessari per il corretto riconoscimento del 3’ss. L’inibizione dello splicing, attraverso l’introduzione di mutazioni a livello del 3’ss o della sequenza esonica identificata, si riflette in un aumento della produzione del miR-34b maturo. Contrariamente, il silenziamento dei due componenti del microprocessore Drosha ed il suo co-fattore DGCR8 abolisce la produzione del miR-34b maturo e migliora l’efficienza dello splicing. La loro overe spressione produce, come atteso, il risultato opposto. La produzione dell’mRNA maturo o del miR-34b a partire dallo stesso trascritto primario `e, pertanto, regolata in maniera antagonistica dallo spliceosoma e dal microprocessore. Per valutare l’influenza generale dello splicing sul processamento dei miRNA, ho analizzato l’effetto del silenziamento del fattore SF3b1 (componente del complesso U2 snRNP, coinvolto nel riconoscimento del 3’ss e con un’alta frequenza di mutazioni in diverse patologie onco ematologiche) sulla produzione degli SO-miRNAs. Ho effettuato un’analisi globale mediante la tecnologia di sequenziamento di piccoli RNA (small RNA-seq) della differenza di espressione dei miRNA come conseguenza della modulazione dello splicing. Il silenziamento di SF3b1 cor rela con un arricchimento significativo degli SO-miRNA la cui produzione `e incrementata nei campioni cellulari con deplezione di SF3b1, rispetto ai controlli non trattati, indicando che lo splicing ha un’influenza diretta sulla biosintesi degli SO-miRNA. Per approfondire la relazione fra lo spliceosoma ed il microprocessore in un contesto fisiologico, ho analizzato tre SO-miRNA espressi nei cheratinociti: il miR-936, il miR-4260 ed il miR-711, appartenenti rispettivamente ai trascritti COL17A1, LAMB3 e COL7A1. Il livello di questi trascritti, espressi nello strato basale dell’epidermide, diminuisce durante il differenziamento dalla strato basale allo strato corneo ed `e correlato ad un aumento di produzione dei rispettivi SO-miRNA. La trasfezione dei tre SO-miRNA esogeni inibisce la proliferazione dei cheratinoc iti, confermando il loro coinvolgimento nel processo di differenziazione. Inaspettatamente il silenziamento di SF3b1 e la differenziazione dei cheratinociti non causano un cambiamento del pattern di splicing degli esoni che comprendono parte degli SO-miRNA. L’analisi dei dati provenienti dal sequenziamento della cromatina dimostra che la deplezione di Drosha `e correlata ad un aumento del livello di trascrizione dei trascritti nascenti a valle dei siti di taglio degli SO-miRNA, suggerendo che il Microprocessore pu`o causare una prematura terminazione della trascrizione dei trascritti che contengono uno SO-miRNA. La competizione tra lo spliceosoma ed il microprocessore rappresenta un nuovo modo per rego lare la produzione di due differenti prodotti genici a partire da un unico trascritto primario. Si ipotizza che alcuni SO-miRNA possano fungere da segnali di terminazione interni ai trascritti e, quando attivati, stimolano la produzione dei miRNA maturi, inibendo la maturazione dei trascritti che sono rapidamente degradati.