TRANSLATIONAL APPROACHES TO IDENTIFY PROGNOSTIC AND PREDICTIVE BIOMARKERS IN NEUROENDOCRINE TUMORS

I tumori neuroendocrini sono neoplasie che originano da cellule del sistema neuroendocrino diffuso che possono insorgere in qualsiasi distretto corporeo. Everolimus è utilizzato per la terapia di tumori neuroendocrini pancreatici (P-NET) e carcinoidi bronchiali (BC), tuttavia alcuni pazienti hanno mostrato resistenza al trattamento. Nell’ambito di tali neoplasie non sono ancora disponibili indicatori predittivi di risposta. Inoltre, una valutazione dell’espressione genica di tessuti di carcinoide bronchiale tipico (TC) e atipico (AC) ha mostrato la ridotta espressione del gene TSC22D1 nei campioni di AC rispetto ai TC. Pertanto lo scopo dello studio è identificare marker predittivi di risposta a Everolimus nei P-NET e capire il ruolo di TSC22D1 come marker prognostico nei BC. Nella prima parte di questo studio, 20 colture primarie di P-NET sono state suddivise in Responder (P-NET-R) e Non Responder (P-NET-NR) in base alla risposta ad Everolimus in termini di vitalità cellulare e attività caspasica. L’espressione di alcune proteine coinvolte nella via di trasduzione del segnale di PI3K/AKT/mTOR è stata valutata mediante AlphaScreen e validata mediante Tissue Microarray ed immunoistochimica (IHC). Sono stati confrontati la risposta ad Everolimus in vitro, i livelli proteici di p-AKT e la risposta ad Everolimus in vivo, in termini di stabilizzazione/progressione di malattia e sopravvivenza. I dati hanno dimostrato che in 6 colture primarie (P-NET-R) Everolimus ha determinato una significativa riduzione della vitalità cellulare e attivazione del processo apoptotico. Invece, 14 colture primarie (P-NET-NR) hanno mostrato resistenza al trattamento. Inoltre, sono stati trovati più alti livelli di espressione di p-IGF1R, p-AKT, p-mTOR e p-4EBP1 nei P-NET-R rispetto ai P-NET-NR. Non è stata trovata correlazione statisticamente significativa tra la positività di p-AKT a livello tissutale e la risposta ad Everolimus in vitro. Inoltre, è stato trovato che un paziente sensibile ad Everolimus in vivo ed in vitro mostrava positività IHC di p-AKT a livello tissutale. Un paziente resistente ad Everolimus sia in vivo che in vitro presentava negatività IHC di p-AKT. Questi dati candidano p-AKT come marker predittivo di risposta a Everolimus nei P-NET. Nella seconda parte dello studio è stata valutata l’espressione di TSC22D1 in 20 campioni di BC mediante Western blot, associandola poi con le caratteristiche clinico-patologiche dei pazienti. È stato inoltre valutato l’effetto del silenziamento di TSC22D1 su migrazione cellulare, vitalità e apoptosi e sull’espressione di alcune proteine coinvolte nel pathway del TGF-β nella linea cellulare di BC (NCI-H727). I risultati hanno dimostrato che il silenziamento di TSC22D1 ha determinato una ridotta capacità migratoria, probabilmente causata da un incremento dell’espressione di E-caderina, una riduzione degli effetti anti-proliferativi e pro-apoptotici del TGF-β, una riduzione dei livelli di espressione di TβR-II e un incremento di Smad 2, Smad 3, Smad 4, Smad 1 e Smad 6 nella linea cellulare NCI-H727. I risultati hanno mostrato che il 50% dei tessuti di BC esprimeva TSC22D1 e non è stata riscontrata associazione tra i livelli proteici di TSC22D1, sesso e Ki-67. Al contrario, l’espressione di TSC22D1 si associava significativamente ad età, estensione del tumore primario e presenza di metastasi ai linfonodi regionali. I pazienti, i tessuti dei quali erano positivi per TSC22D1, erano caratterizzati da giovane età, tumore primitivo più esteso, coinvolgimento metastatico dei linfonodi regionali e da più breve sopravvivenza libera da progressione di malattia rispetto ai pazienti i tessuti dei quali erano negativi per TSC22D1. Poiché l’espressione di TSC22D1 sembra associarsi con un comportamento clinico più aggressivo nei BC, questi dati suggeriscono che esso potrebbe essere considerato un potenziale marker prognostico nei BC.

Neuroendocrine tumors (NETs) are a spectrum of neoplasms arising from neuroendocrine cells spread throughout the body. NETs are characterised by different biological behaviour, histological appearance and clinical outcome. Many patients display metastases at the time of diagnosis, and few therapeutic options are currently available. Everolimus has demonstrated to be effective in a number of patients with pancreatic neuroendocrine tumor (P-NET) and bronchial carcinoid (BC), which therefore may take advantage of Everolimus treatment. However, this mTOR inhibitor has shown a variable efficacy due to the development of primary or acquired resistance. In addition, microarray data analysis obtained comparing a pool of typical (TC) with a pool of atypical (AC) BC samples showed the down-regulation of a gene called TSC22D1 in AC samples. New insights in the molecular biology of NETs are essential; therefore, the aim of our study was to identify new putative predictive/prognostic biomarkers in neuroendocrine tumors, by using two NET models, P-NETs and BCs. In the first part of this study, we found that Everolimus reduced cell viability and induced apoptosis in 6 P-NETs primary cultures (P-NET-R), where the proliferative and anti-apoptotic effects of IGF-1 were blocked by Everolimus. On the contrary, 14 P-NETs primary cultures were non-responders to Everolimus and IGF-1 treatments (P-NET-NR), suggesting an involvement of IGF-1 pathway in the mechanism of resistance to Everolimus. We also found that the response to Everolimus in vitro was associated with high levels of p-IGF1R, p-AKT, p-mTOR, p-4EBP1, and seemed to be associated with a greater clinical aggressiveness. In addition, we observed that p-AKT immunohistochemistry was positive in a patient, considered responder in vitro, who showed tumor stabilization after Everolimus treatment in vivo. On the other hand, p-AKT immunohistochemistry was negative in a patient, non-responder in vitro and who showed tumor progression after 12 months of treatment with Everolimus in vivo. These data may candidate p-AKT as predictive marker of response to Everolimus in P-NET. In the second part of this study, we found TSC22D1 protein expression in 50% of human BC tissues. Furthermore, our results indicate that TSC22D1 might modulate cell migration as well as sensitivity to TGF-β in BC cells. TSC22D1 silencing determined a decreased cell migration, probably caused by an up-regulation of E-cadherin, and reduced the anti-proliferative and pro-apoptotic effects induced by TGF-β, by modifying TGF-β signalling pathway expression. In addition, molecular, clinical-and pathological characteristics of the patients were associated with the TSC22D1 expression. No association between TSC22D1 protein levels and sex and ki-67 was found. On the contrary a significant association was found between TSC22D1 expression levels, age, tumor size and nodal status. The patients with BCs positive for TSC22D1 were younger and characterised by a higher tumor grade, nodal status and shorter progression free survival (PFS) as compared to those patients with BCs negative for this protein. Therefore, TSC22D1 expression seems to associate with a more aggressive behaviour in BC. These data suggest that TSC22D1 may be considered as a potential prognostic biomarker in BC patients.