Mouse TDP-43 expression during development is epigenetically modulated

La Sclerosi Laterale Amiotrofica SLA e una malattia neurodegenerativa con progressiva degenerazione e morte dei motoneuroni. L’eta media d’insorgenza varia tra i 50 e i 60 anni. Il 95% dei pazienti di SLA presenta nel cervello inclusioni patologiche costituite soprattutto dalla proteina TDP43 TAR DNA binding protein 43 nella sua forma aggregata. Il sequestro di TDP43 negli aggregati ne provoca la perdita funzionale. Studi svolti nel nostro laboratorio hanno sviluppato un modello cellulare di aggregazione di TDP43 basato sull’espressione inducibile di una TDP43 transgenica modificata in modo tale da aggregare facilmente e capace di sequestrare la proteina endogena. Con lo stesso principio e stato sviluppato un modello transgenico di Drosophila che manifesta sintomi tipici della SLA quali l insorgenza tardiva di difetti nella locomozione. Di particolare interesse e stata l’osservazione che l insorgenza del fenotipo patologico coincide con una riduzione nel cervello della proteina e dell’mRNA di TBPH ortologo di TDP43 in Drosophila correlata all’eta. Inoltre, nello stesso modello, la riduzione artificiale di TDP43 causa una anticipazione del fenotipo patologico. Queste osservazioni collegano per la prima volta bassi livelli cellulari di TDP43 con l esordio di sintomi patologici. Il calo fisiologico di TDP43 e stato osservato anche nel cervello del topo. Abbiamo quindi deciso di estendere l analisi dei livelli di TDP43 a differenti eta e tessuti, nel topo e in altri organismi. Da questo studio e risultato che TDP43 e espressa diversamente dipendentemente dall eta e dal tessuto considerati. Infatti sebbene altamente espressa nelle prime fasi dello sviluppo post natale nel cervello, nel muscolo scheletrico e nel fegato, la sua espressione cala drasticamente nell’animale adulto 90 giorni nel muscolo scheletrico, cala leggermente nel cervello e resta invariata nel fegato. Questo comportamento peculiare dell espressione di TDP43 e stato esteso anche ad altri membri della famiglia delle proteine che legano l’RNA RBPs. Studi di epigenetica nel topo hanno rivelato che i livelli di metilazione del promotore di TARDBP hanno specificita tissutale e sono dipendenti dalla fase di sviluppo, inoltre mostrano correlazione inversa all’espressione di TDP43 nel cervello e nel muscolo, mentre nel fegato, dove TDP43 è espressa costantemente, i livelli di metilazione non cambiano. Considerando che i siti CG altamente metilati nel promotore di TARDBP di colture di motoneuroni murini NSC34 coincidono con quelli metilati nei topi, abbiamo verificato in queste cellule la correlazione tra metilazione del promotore di TDP43 e produzione di proteina attraverso trattamenti demetilanti con l azacitidina. Come previsto, abbiamo osservato un incremento nei livelli di mRNA e proteina dipendenti dal tempo del trattamento e dalla dose di farmaco. In accordo con questi risultati, mediante un saggio di metilazione in vitro del promotore di TARDBP, abbiamo osservato un calo nella produzione di TDP43 in cellule NSC34. Infine, abbiamo osservato che la mutagenesi puntiforme per prevenire la metilazione di specifici siti CG maggiormente metilati nel promotore, causa l’aumento dell’attivita trascrizionale. Infine, simili esperimenti di demetilazione effettuati in una linea cellulare neuronale umana hanno prodotto medesimi risultati di incremento di produzione di TDP43 come osservato nelle NSC34. In conclusione, i nostri dati suggeriscono che i livelli di mRNA e proteina di TDP43 nel topo sono regolati in maniera tessuto ed eta specifica e questo comportamento può essere esteso ad altri membri della famiglia di proteine che legano l’RNA. Cambiamenti nello stato di metilazione del promotore di TARDBP correlano inversamente con l’espressione di TDP43 nel topo e dati preliminari suggeriscono che la metilazione potrebbe giocare un ruolo fondamentale anche nella regolazione di TDP43 nell’uomo

Amyotrophic lateral sclerosis ALS is a fatal neurodegenerative disease with a median age of onset of 50-60 years. 95% of ALS cases show inclusions of an aggregated form of the hnRNP TAR DNA-binding protein 43 TDP43, resulting in its nuclear clearance and loss of function. Previously our laboratory has developed an aggregation model based on the TDP43 prion like sequence and it was shown that the aggregates induced are capable of sequestering endogenous TDP43 or TBPH in the case of Drosophila and inducing loss of function. Particularly interesting for our studies was the observation that there was a late onset of a locomotion defects in the fly that coincided with an age related reduction of TBPH protein and mRNA levels in the brain. This suggests that the pathology onset may, in part, be determined by the physiological age related decrease in expression of TDP43. In fact it can be hypothesized that the continuous sequestering of newly synthesized TBPH TDP43 by the aggregates becomes critical only when the amount of newly synthesised TDP43 can no longer compensate this process. This physiological drop has been observed to be evolutionary conserved in Drosophila and mice. We have decided to extend the analysis of TDP43 expression during development to different ages and tissues in mouse and other organisms. We found that TDP43 showed different trends of expression that are time and tissue specific. In fact, even if ubiquitously highly expressed at the early post natal developmental stage in brain and some peripheral organs like liver and skeletal muscle, expression decays dramatically at 90 days after birth in the skeletal muscle, mildly in brain and does not vary in liver. We also observed this peculiar age related changes in other splicing related RNA binding proteins. The phenomena deserve further analysis and we have focused in the mechanism responsible for the lower transcription rate. Epigenetic studies in mice revealed that DNA methylation levels of the TARDBP promoter have tissue and developmental stage specificity that have an inverse correlation with TDP43 expression. In particular, in 90 days aged mice, the 4th CpG island of TARDBP promoter displays an increase in the methylation rate of the majority of its CG sites in the skeletal muscle where TDP43 dramatically decrease while a lower number of CG sites increased their methylation rate in brain where the protein mildly decrease during development. On the other hand no significant methylation rate changes have been detected in liver where TDP43 is sustained during time. We also found that the highly methylated CG sites of the cultured mouse motorneurons NSC34 TARDBP promoter perfectly match with the CG sites significantly methylated in mice. Furthermore, azacytidine demethylating treatment of this cell line leads to an increase in the level of TDP43 mRNA and protein expression in a dose and time dependent manner. Accordingly, through an in vitro methylation assay we observed that mouse TARDBP promoter significantly decreased its activity in NSC34 cells. Moreover, we found that point mutagenesis to prevent methylation of the specific CG dinucleotides that we found as the most methylated in the promoter fourth island leads to an increased TARDBP mouse promoter activity. Interestingly, azacytidine demethylation treatment of the human neuronal cell line SHSY5Y has the same effect of increasing TDP43 mRNA production observed in mouse motorneurons. In conclusion, our data suggest that mouse TDP43 mRNA and protein levels are regulated in a tissue specific and time dependent manners and this behaviour can eventually be extended to other members of the RNA binding proteins family. Changes of TARDBP promoter methylation status in the different mice tissues during development and aging are inversely correlated with TDP43 expression and preliminary data suggest that TARDBP promoter methylation could be a pivotal player also in the regulation of human TDP43