Isolation and characterization of cellulolytic enzymes from the digestive fluid of Rhynchophorus palmarum larvae

Lo scopo di questa ricerca è l’isolamento e caratterizzazione di enzimi cellulosolitici dal fluido intestinale di larve di Rhynchophorus palmarum. La parte sperimentale di questa ricerca è stata divisa in due fasi. Inizialmente sono stati isolati i microrganismi presenti nel tratto digestivo di R. palmarum, dal quale sono stati isolati un totale di 11 diversi batteri e 4 tra funghi e lieviti. Dato che, il R. palmarum è inserito nella lista di controllo e restrizione della European and Mediterranean Plant Protection Organization (Eppo), è stato deciso di utilizzare le larve di R. ferrugineus, allo scopo di sviluppare i protocolli di isolamento dei microrganismi cellulosolitici. I medesimi protocolli sono stati utilizzati in Ecuador con larve di R. Palmarum. L’attività cellulosolitica di questi microrganismi è stata valutata inizialmente con un metodo qualitativo che prevede l’utilizzo di Congo red e l’incubazione dei microrganismi su terreno agarizzato contenente carbossimetil-cellulosa (CMC) come unica fonte di carbonio. Dall’analisi del microbiota, è stato selezionato un fungo appartenete al philum degli Ascomiceti, genere Thielaviopsis, specie ethacetica, nel quale è stata riscontrata la maggiore attività cellulosolitica. Successivamente, sono state valutate come le variazioni di pH e temperatura di coltura influenzano l’attività enzimatica. Questo è stato fatto adottando il metodo statistico D-optimal affiancato ad una superficie di risposta. È stato dimostrato che T. ethacetica ha il suo massimo di attività cellulosolitica a pH 4 e ad una temperatura di 20 °C. Per l’isolamento degli enzimi cellulosolitici, T. ethacetica è stato incubato in un brodo di coltura contenente CMC a pH 4 e ad una temperatura di 20 °C. Dopo 5 giorni di crescita il brodo è stato filtrato e trattato con ammonio solfato per la precipitazione proteica. L’estratto enzimatico è stato testato per determinare l’optimum di temperatura e pH e la sua stabilità in queste condizioni. È stato dimostrato che gli enzimi cellulosolitici di T. ethacetica esprimono la loro massima attività a pH4.5 e ad una temperatura di 45 °C. In queste condizioni, gli enzimi cellulosolitici di T. ethacetica sono stabili per 48 ore.

The aim of this research is the isolation and characterization of cellulolytic enzymes from the intestinal fluid of Rhynchophorus palmarum larvae. The experimental stage of this research was divided in two approaches. Initially, cellulolytic microorganisms were isolated from the digestive tract of Rhynchophorus palmarum larvae. A total of 11 bacteria and four fungi and yeast were isolated as result. Additionally, since R. palmarum is listed in the control and restriction list of the European and Mediterranean Plant Protection Organization (EPPO), it was decided to use R. ferrugineus larvae to develop the protocols for the isolation of cellulolytic microorganisms. These protocols were later replied in Ecuador with R. palmarum larvae. Cellulolytic activity of microbial isolates was tested by staining with Congo red after incubation in a modified substrate with carboxymethylcellulose (CMC) as single source of carbon. As result, a fungus belonging to the Ascomycetes phylum, genus Thielaviopsis species ethacetica, was found to exhibit major cellulolytic activity. In addition, the influence of incubation pH and temperature on the cellulolytic activity of T. ethacetica was evaluated with a D-optimal statistical design, plotted into a response surface. It was found that T. ethacetica has a maximum cellulolytic activity when incubated at pH 4.0 and 20°C. For the isolation of cellulolytic enzymes, T. ethacetica was incubated at pH 4.0 and 20°C. After four days the incubation broth was treated with ammonium sulfate for protein precipitation. The enzymatic crude extract was assayed in order to determine it optimal pH and temperature as well as the stability at optimized conditions. It was found that cellulolytic enzymes of T. ethacetica exhibit maximum activity at pH 4.5 and 45°C. In these conditions, cellulolytic enzymes of T. ethacetica are stable for 48 hours.