NOP and mu opioid receptors: novel ligands and therapeutic opportunities

Lo scopo dello studio è stato quello di caratterizzare nuovi ligandi e studiare nuove opportunità terapeutiche per il recettore N/OFQ – NOP e i classici recettori oppioidi. I recettori NOP e oppioidi sono recettori 7TM accoppiati con proteine G inibitorie. Questi recettori controllano diverse funzioni biologiche, come la trasmissione del dolore e la modulazione degli stati emotivi. Il concetto farmacologico di selettività funzionale (alias bias agonism) potrebbe essere utile per amplificare azioni benefiche e/o contrastare gli effetti collaterali. Per studiare il potenziale dell biased agonism, sono necessarie nuove molecole con un grande fattore di polarizzazione verso la proteina G e/o l'arrestina. Nei nostri laboratori, abbiamo studiato la relazione struttura-attività specifica dell'effettore (proteina G vs arrestina) dell'agonista pieno del recettore NOP N/OFQ (1-13)-NH2 e dei suoi derivati negli studi in saggio BRET. I migliori risultati in termini di bias factor sono stati ottenuti quando sono state applicate modifiche con sequenze peptidiche caricate positivamente o catene alifatiche lineari al terminale C di N/OFQ (1-13)-NH2: tali cambianti hanno generato agonisti NOP polarizzati verso la proteina G. Inoltre, sono stati condotti anche esperimenti per valutare l'effetto in vivo dei ligandi NOP già descritti in vitro Ro 65-6570, AT-403 e MCOPPB sull'analgesia e sull'attività locomotoria. Degno di nota, Ro 65-6570 ha dimostrato un indice terapeutico leggermente più elevato (effetti antinocicettivi vs sedativi) nei topi βarr2(-/-). Tuttavia, tutti gli agonisti NOP hanno mostrato un indice terapeutico molto simile nei topi wild type nonostante differenze significative quanto riguarda sua bias factor. In conclusione, la diversa capacità di attivare la proteina G rispetto al reclutamento di βarr2 di un agonista NOP non può predire le sue proprietà analgesiche rispetto a quelle sedative. Inoltre, in esperimenti in vivo volti ad analizzare le strategie di stress coping gli antagonisti del recettore NOP sono stati somministrati prima dello stimolo stressante e si sono dimostrati efficaci nel prevenire lo sviluppo di comportamenti simili alla depressione. Tali antagonisti potrebbero essere utilizzati non solo per la cura dei pazienti depressi ma anche per prevenire episodi depressivi in pazienti ad alto rischio Per quanto riguarda gli recettori oppioidi, nuovi oppioidi sintetici sono stati caratterizzati farmacologicamente in vitro. Tra questi, MT-45 si è comportato come un potente agonista mu selettivo con un'efficacia leggermente superiore rispetto alla morfina nel saggio di ridistribuzione della massa dinamica (DMR). Inoltre, i derivati del fentanile sono stati caratterizzati in vitro utilizzando il saggio della mobilizzazione del calcio e saggi BRET. Le diverse modificazioni chimiche presenti in questi derivati del fentanil non alterano in modo significativo le proprieta’ farmacodinamiche della molecola e tutti i composti si sono comportati quali agonisti potenti e selettivi del recettore mu. Infine, proseguendo lo sviluppo di ligandi bifunzionali per i recettori NOP e mu oppioide, è stata messa a punto una nuova metodologia sintetica al fine di ottenere ligandi peptidici etero tetramerici. Tali molecole potrebbero essere utili nello specifico per valutare il potenziale terapeutico degli agonisti misti NOP/mu in analgesia e piu’ in genenerale per lo studio delle conseguenze dell'attivazione e/o blocco simultaneo di diversi recettori peptidergici. Sono stati sintetizzati una serie di derivati peptidici eteromerici, e tra questi, H-PWT1-N/OFQ-[Dmt1]dermorphin si e’ dimostrato un potente agonista sia per il recettore NOP che per il recettore mu oppioide. In conclusione, l'attività di ricerca svolta durante il corso di dottorato ha contribuito ad aumentare le nostre conoscenze su nuove strategie che possono essere utili per lo sviluppo di farmaci analgesici innovativi e più sicuri.

The aim of the study was to characterize new ligands and study new therapeutic opportunities for the N / OFQ - NOP receptor and the classic opioid receptors. The NOP and opioid receptors are 7TM receptors coupled with inhibitory G proteins. These receptors control various biological functions, such as the transmission of pain and the modulation of emotional states. The pharmacological concept of functional selectivity (aka bias agonism) could be useful for amplifying beneficial actions and / or counteracting side effects. To study the potential of biased agonism, new molecules with a large polarization factor towards the G protein and / or arrestin are needed. In our laboratories, we investigated the effector-specific structure-activity relationship (protein G vs arrestin) of the NOP receptor full agonist N/OFQ(1-13)-NH2 and its derivatives in BRET assay studies. The best results in terms of bias factor were obtained when modifications were applied with positively charged peptide sequences or linear aliphatic chains at the C-terminus of N/OFQ(1-13)-NH2: these changes generated NOP agonists polarized towards the protein G. Furthermore, experiments were also conducted to evaluate the in vivo effect of the NOP ligands already described in vitro Ro 65-6570, AT-403 and MCOPPB regarding analgesia and locomotor activity. Of note, Ro 65-6570 demonstrated a slightly higher therapeutic index (antinociceptive vs sedative effects) in βarr2(-/-) mice. However, all NOP agonists showed a very similar therapeutic index in wild type mice despite significant differences regarding their bias factor. In conclusion, the different ability to activate the G protein with respect to the recruitment of βarr2 of a NOP agonist cannot predict the analgesic properties compared to the sedative ones. Furthermore, in vivo experiments aimed at analyzing stress coping strategies, NOP receptor antagonists were administered before the stressful stimulus and proved effective in preventing the development of depression-like behaviors. Such antagonists could be used not only for the treatment of depressed patients but also to prevent depressive episodes in high-risk patients. Regarding opioid receptors, new synthetic opioids have been pharmacologically characterized in vitro. Among them, MT-45 performed as a potent selective mu agonist with slightly higher efficacy than morphine in the dynamic mass redistribution (DMR) assay. Furthermore, fentanyl derivatives were characterized in vitro using the calcium mobilization and BRET assays. The different chemical modifications presented in these fentanyl derivatives did not significantly alter the pharmacodynamic properties of the molecule and all the compounds behaved as potent and selective agonists of the mu receptor. Finally, continuing the development of bifunctional ligands for NOP and mu opioid receptors, a new synthetic methodology was developed in order to obtain hetero tetrameric peptide ligands. These molecules could be specifically useful for evaluating the therapeutic potential of NOP/mu mixed agonists in analgesia and more generally for the study of the consequences of the simultaneous activation and/or blocking of different peptidergic receptors. A series of heteromeric peptide derivatives have been synthesized, and among these, H-PWT1-N/OFQ- [Dmt1] dermorphin proved to be a powerful agonist for both the NOP receptor and the mu opioid receptor. In conclusion, the research activity carried out during the PhD course has contributed to increasing our knowledge on new strategies that can be useful for the development of innovative and safer analgesic drugs.