Regulation of exon definition by intrinsic elements and by combination of tailored U1snRNA with antisense oligonucleotides

The notion that a significant proportion of disease-causing mutations affects pre-mRNA boosted research towards the design of approaches modulating this very complex process for therapeutic purposes. This PhD project has been focused on the development of RNA-based correction approaches for Hemophilia B (HB) or Seckel syndrome, hemorrhagic or neurologic disorders due to mutations in the F9 or ATR genes, respectively. Previous studies by our research group on a panel of HB-causing mutations led to the development of variants of the U1 small nuclear RNA (U1snRNA), key component of the spliceosomal U1 small nuclear ribonucleoprotein, which can rescue exon inclusion by targeting intronic sequences downstream of a defective exon (Exon-specific U1snRNA, ExSpeU1). Most importantly, it has been proven in cellular models that a unique ExSpeU1fx9 can rescue aberrant splicing caused by multiple exon-skipping mutations occurring at the donor (5’ss) or acceptor (3’ss) splice sites of the F9 exon 5. Here, by expressing the human F9 splicing-defecting expression cassettes in mouse liver, we provided the first in vivo proof-of-concept that the selected ExSpeU1fix9 is able to restore F9 splicing and remarkably increase human factor IX (FIX) protein levels and coagulant activity in plasma in the presence of two model exon-skipping mutations at the 5’ss (c.519A>G) or 3’ss (c.392-8T>G) In the model of F9 exon 2, through the expression of F9 minigenes in mammalian cells, we characterized numerous HB-causing mutations, either missense or at the 5’ss , that promote aberrant splicing by inducing the usage of a strong exonic cryptic 5’ss. Splicing assays with natural and artificial F9 variants indicated that the cryptic 5’ss is regulated, among a network of regulatory elements, by an exonic splicing silencer (ESS). This finding supports a compensatory mechanism aimed at minimizing unproductive splicing. To recover splicing we tested antisense oligo-ribonucleotides (AON) masking the cryptic 5’ss, which were effective on exonic changes but promoted exon 2 skipping in the presence of mutations at the authentic 5’ss. On the other hand, we observed a very poor correction effect by U1snRNA variants with increased or perfect complementarity to the defective 5’ss. Noticeably, the combination of the mutant-specific U1snRNAs with antisense oligonucleotides produced appreciable amounts of correctly spliced transcripts from several mutants of the exon 2 5’ss. In the Seckel Syndrome (SS-1) model we characterized the synonymous c.A2101G change in exon 9 of the ATR gene that induces exon 9 skipping by creating an exonic splicing silencer (ESS) in the poorly defined exon. Based on this mechanism, we explored two complementary correction strategies based on AON, designed to mask the ESS and modified U1snRNA, improving exon 9 definition. In ATR minigene assays demonstrated that both the AON and the U1snRNAATR induced a robust exon 9 inclusion raising from 6% to 100% and 63%, respectively. The U1snRNAATR was then challenged in the embryonic fibroblasts from the humanized SS-1 mouse model (MEFSS-1) harboring the SS1 splicing mutation. The lentiviral-mediated delivery of the U1snRNAATR in MEFSS-1 resulted in partial rescue of exon 9 inclusion and in the low but appreciable increase of ATR protein expression. Taken together these data in the hemophilia B and Seckel syndrome models demonstrate the ability of appropriately designed RNA-based approaches to counteract splicing mutations and rescue gene expression, thus encouraging their exploitation for the development of innovative therapies for genetic disorders.

Mutazioni che coinvolgono l’RNA messaggero rappresentano una causa relativamente frequente di malattia; negli ultimi anni la ricerca ha potenziato l’interesse in questo ambito, promuovendo lo sviluppo di approcci terapeutici in grado di modulare questo processo molto complesso. Il lavoro di questa tesi riguarda lo sviluppo di strategie innovative, che vanno ad agire a livello dell’RNA, per tentare di correggere mutazioni presenti nel gene del fattore IX della coagulazione e nel gene ATR, e che causano rispettivamente patologie quali l’Emofilia B e la Sindrome di Seckel. Studi precedenti condotti nel nostro gruppo di ricerca hanno dimostrato che mediante l’utilizzo di varianti di U1 small nuclear RNA (U1snRNA), componente chiave della ribonucleoproteina U1 coinvolta nel processo di splicing, e in grado di legarsi a valle dell’esone contenente la mutazione (Exon-specific U1, ExSpeU1) si è in grado di ripristinare il corretto processamento del messaggero. Inoltre è stato visto che, in modelli cellulari, un’unica ExSpeU1fx9 è capace di ripristinare lo splicing aberrante causato da mutazioni che inducono il salto dell’esone e localizzate sia a livello del sito donatore (5’ss) o accettore (3’ss) nell’esone 5 del fattore IX della coagulazione. Attraverso studi di espressione di varianti mutate del fattore IX in modelli murini, è stato dimostrato per la prima volta che la ExSpeU1fix9 è in grado di ripristinare il corretto processamento del messaggero, risultante in livelli di proteina circolante e con attività coagulante nei due modelli di mutazioni al 5’ss (c.519A>G) e 3’ss (c.392-8T>G). Inoltre, attraverso l’espressione di minigeni in cellule eucariotiche, sono state caratterizzate numerose mutazioni (missenso e al 5’ss) nell’esone 2 del fattore IX della coagulazione, le quali producono uno splicing aberrante a causa dell’ utilizzo di un sito alternativo all’interno dell’esone. Esperimenti condotti utilizzando sia varianti naturali che non, hanno dimostrato che l’uso di questo sito alternativo è regolato dalla sinergia di elementi regolatori comprendenti un elemento silenziatore (Exonic splicing silencer ESS). Con lo scopo di ripristinare il corretto processamento del messaggero, sono stati testati degli oligonucleotidi antisenso (AON) per mascherare il sito alternativo. Tali AON sono risultati efficaci per le mutazioni esoniche ma hanno indotto il salto dell’esone 2 in presenza di mutazioni al sito donatore 5’ autentico. Parallelamente, è stata osservata una ridotta correzione dopo l’utilizzo di varianti di U1snRNA perfettamente complementari al sito donatore mutato. E’ interessante invece osservare che l’utilizzo combinato degli oligonucleotidi antisenso con le U1snRNA modificate ha indotto una correzione apprezzabile del processamento dell’RNA in presenza di mutazioni nel sito donatore. Nel modello della Sindrome di Seckel (SS-1) è stata caratterizzata la mutazione sinonima c.A2101G presente nell’esone 9 del gene ATR, la quale provoca il salto dell’esone stesso introducendo un elemento silenziatore (ESS) in un contesto già naturalmente poco definito. In maniera sinergica sono state esplorate due strategie di correzione basate su un AON, utilizzato per mascherare l’elemento silenziatore, e una U1snRNA modificata, con lo scopo di migliorare la definizione dell’esone 9. Utilizzando la strategia dei minigeni si è potuto osservare che entrambi gli approcci sono in grado di ripristinare l’inclusione dell’esone 9, che passa dal 6% al 100% e 63% a seconda dell’approccio utilizzato. La U1snRNA modificata è stata successivamente testata in fibroblasti murini umanizzati per la mutazione causativa di malattia (MEFSS-1). La veicolazione di questa U1snRNA mediante l’utilizzo di un lentivirus modificato ha portato a una parziale inclusione dell’esone 9 e, anche se in minor quantità, anche ad un aumento dell’espressione di ATR a livello proteico. Complessivamente, i dati ottenuti nei modelli di Emofilia B e Sindrome di Seckel dimostrano l’abilità di questi approcci nel correggere gli effetti delle mutazioni di splicing, e l’abilità nel ripristinare l’espressione genica. Questi dati incoraggiano lo sviluppo di terapie innovative basate sull’utilizzo di AON e U1snRNA modificate per la cura di malattie genetiche.