Gli acidi peptido-nucleici (PNA), sono analoghi sintetici del DNA nei quali lo scheletro fostodiesterico è stato sostituito con unità ripetute di N-(2-aminoetil)-glicina. Essendo a carica neutra, ibridizzano al DNA con affinità molto maggiore rispetto a oligo-DNA o -RNA. I PNA sono stabili e resistenti a nucleasi e proteasi. Poiché i PNA ibridizzano al DNA genomico in modo sito-specifico, sono possibili candidati per lo sviluppo di strategie innovative di “genome editing”, ad esempio basate sull’utilizzo di tail-clamp PNA (tcPNA) disegnati in modo da legare contemporaneamente sia un tratto omopurinici/omopirimidinico del DNA formando triple eliche (triplex), sia una regione contigua producendo un duplex DNA/PNA attraverso “strand-invasion”. La formazione di questi legami vicino ad una mutazione genica, crea distorsione nell’elica riconosciuta dai meccanismi cellulari di riparo del DNA, i quali utilizzando un DNA templato donatore contenente la sequenza non mutata, possono correggere in modo permanente il genoma attraverso ricombinazione omologa. Lo scopo del progetto è disegnare e utilizzare tcPNA per correggere mediante genome editing la mutazione talassemica β°39, che essendo una mutazione di stop, causa la completa assenza di catene β-globiniche. Per la validazione, verrà creato un modello cellulare GFP-β°39mut, costituito da cellule K562 trasfettate con un lentivirus mutagenizzato in modo da contenere la mutazione β°39 nella sequenza codificante GFP, causando l’abolizione della produzione della proteina e relativa fluorescenza intracellulare (Fig.1). Per il delivery cellulare delle molecole tcPNA verranno utilizzate nuove molecole a struttura callixarenica che consentono un’elevata efficienza di delivery dei PNA. Disegneremo tcPNA in grado di legare regioni del gene GFP limitrofe alla mutazione talassemica β°39. Questi PNA verranno veicolati nelle cellule insieme ad una sequenza di DNA donatore contenente la sequenza non-mutata (Fig.2). Andando a verificare i livelli di produzione di GFP mediante analisi della fluorescenza cellulare potremo determinare la capacità di correzione genica confrontando la tecnica basata sui PNA con approcci classici di gene editing, come il metodo CRISPR/Cas9. I risultati ottenuti potranno essere ulteriormente validati utilizzando altri modelli cellulari già a nostra disposizione, quali cellule K562-β°39 contenenti il transgene β-globinico mutato, progenitori eritroidi CD34+ isolati da pazienti talassemici β°39 omozigoti e linee murine transgeniche per la mutazione β°39. L’impiego di tcPNA potrebbe essere utilizzato per la correzione di mutazioni puntiformi anche in altre patologie genetiche, offrendo il vantaggio di una maggior sicurezza e di livelli molto più ridotti di effetti off-target rispetto agli approcci di gene editing basati sulle nucleasi, offrendo la possibilità di effettuare trattamenti multipli per raggiungere effetti terapeutici più significativi.
Acidi peptido-nucleici (PNA) per il Genome Editing in β-talassemia: correzione sito-specifica della mutazione β°39
Finotti A
2018
Abstract
Gli acidi peptido-nucleici (PNA), sono analoghi sintetici del DNA nei quali lo scheletro fostodiesterico è stato sostituito con unità ripetute di N-(2-aminoetil)-glicina. Essendo a carica neutra, ibridizzano al DNA con affinità molto maggiore rispetto a oligo-DNA o -RNA. I PNA sono stabili e resistenti a nucleasi e proteasi. Poiché i PNA ibridizzano al DNA genomico in modo sito-specifico, sono possibili candidati per lo sviluppo di strategie innovative di “genome editing”, ad esempio basate sull’utilizzo di tail-clamp PNA (tcPNA) disegnati in modo da legare contemporaneamente sia un tratto omopurinici/omopirimidinico del DNA formando triple eliche (triplex), sia una regione contigua producendo un duplex DNA/PNA attraverso “strand-invasion”. La formazione di questi legami vicino ad una mutazione genica, crea distorsione nell’elica riconosciuta dai meccanismi cellulari di riparo del DNA, i quali utilizzando un DNA templato donatore contenente la sequenza non mutata, possono correggere in modo permanente il genoma attraverso ricombinazione omologa. Lo scopo del progetto è disegnare e utilizzare tcPNA per correggere mediante genome editing la mutazione talassemica β°39, che essendo una mutazione di stop, causa la completa assenza di catene β-globiniche. Per la validazione, verrà creato un modello cellulare GFP-β°39mut, costituito da cellule K562 trasfettate con un lentivirus mutagenizzato in modo da contenere la mutazione β°39 nella sequenza codificante GFP, causando l’abolizione della produzione della proteina e relativa fluorescenza intracellulare (Fig.1). Per il delivery cellulare delle molecole tcPNA verranno utilizzate nuove molecole a struttura callixarenica che consentono un’elevata efficienza di delivery dei PNA. Disegneremo tcPNA in grado di legare regioni del gene GFP limitrofe alla mutazione talassemica β°39. Questi PNA verranno veicolati nelle cellule insieme ad una sequenza di DNA donatore contenente la sequenza non-mutata (Fig.2). Andando a verificare i livelli di produzione di GFP mediante analisi della fluorescenza cellulare potremo determinare la capacità di correzione genica confrontando la tecnica basata sui PNA con approcci classici di gene editing, come il metodo CRISPR/Cas9. I risultati ottenuti potranno essere ulteriormente validati utilizzando altri modelli cellulari già a nostra disposizione, quali cellule K562-β°39 contenenti il transgene β-globinico mutato, progenitori eritroidi CD34+ isolati da pazienti talassemici β°39 omozigoti e linee murine transgeniche per la mutazione β°39. L’impiego di tcPNA potrebbe essere utilizzato per la correzione di mutazioni puntiformi anche in altre patologie genetiche, offrendo il vantaggio di una maggior sicurezza e di livelli molto più ridotti di effetti off-target rispetto agli approcci di gene editing basati sulle nucleasi, offrendo la possibilità di effettuare trattamenti multipli per raggiungere effetti terapeutici più significativi.I documenti in SFERA sono protetti da copyright e tutti i diritti sono riservati, salvo diversa indicazione.
