La regolazione dell’espressione del gene per il Recettore dell’Estrogeno α (ERα) in osteoblasti umani: ruolo di Runx2, AP-1 e NFATc1

Lo studio di questa tesi è stato rivolto all’analisi di specifiche zone regolative del gene umano per il Recettore dell’Estrogeno α (hERα) in cellule di osso, osteoblasti e osteoclasti. In queste cellule la trascrizione del gene ERα è diretta dal promotore distale F il quale, insieme a 6 diversi altri promotori ad attività tessuto specifica, fa parte della complessa regione 5’ del gene. Sulla base di evidenze che sono state raccolte mediante un’analisi bioinformatica, lo studio ha preso in considerazione putativi siti di legame per i fattori (TF) Runx2, NFATc1, AP-1 e ERα, allo scopo di far luce sui meccanismi che regolano l’espressione del gene ERα stesso, il quale gioca un ruolo centrale nel metabolismo osseo. In particolare la ricerca si è concentrata su quei TF che numerosi studi hanno indicato come regolatori essenziali dell’osteoblasteogenesi e dell’osteclasteogenesi, e che pertanto possono risultare buoni candidati per una terapia mirata basata sulla modulazione dell’espressione di geni specifici. E’ stato infatti dimostrato che molte patologie del tessuto osseo sono caratterizzate da attività anomale di alcuni TF, tra cui quelli considerati in questa tesi. MODELLI SPERIMENTALI: Linee cellulari di osteosarcoma, colture primarie di osteoblasti (OBs). METODOLOGIA: RT-PCR e WESTERN BLOT (per l’analisi dell’espressione), EMSA (saggio di ritardo della corsa elettroforetica) e ChIP (saggio di immunoprecipitazione della cromatina) (per l’analisi in vitro e in vivo delle interazioni DNA- proteina), REPORTER GENE ASSAY (per l’analisi dell’attività del promotore), siRNA (per il silenziamento genico), MUTAGENESI SITO SPECIFICA (per la mutazione dei siti di legame) PRINCIPALI RISULTATI OSTEOBLASTI: RUNX2 si lega in modo specifico a due (a e b) dei tre siti identificati. Al sito a (5’- AACCACA-3’) si lega come repressore, al sito b (AACCTCA) come attivatore. La scoperta di questo duplice ruolo di Runx2 suggerisce che il suo coinvolgimento nella regolazione di ERα si fortemente determinato dai livelli di espressione di Runx2 stesso, come confermato dagli esperimenti di silenziamento e iperespressione. ERα si lega per lo più in modo indiretto alla sequenza “half ERE” e AP-1 associandosi in vivo con alcuni membri della famiglia AP-1. Le combinazioni più probabili che sono state evidenziate sono c-jun/c-fos, ATF-2/ ATF-2, and ERα/ATF-2. Queste interazioni sono dipendenti dall’estrogeno e seguono una cinetica oscillatoria. NFATc1 è un regolatore negativo di ERα. Mediante esperimenti di “decoy” è stato possibile modulare positivamente l’espressione di ERα sottraendo con un oligonucleotide specifico il fattore NFATc1. Poiché questo TF è il principale sostenitore dell’attività erosiva della matrice ossea da parte degli Osteoclasti, l’aver scoperto un suo ruolo negativo nella regolazione di ERα, conferma l’attività osteoprotettiva di ERα e apre la strada per possibili nuove strategie terapeutiche per combattere le malattie osteopeniche come l’osteoporosi.