Caratterizzazione della corrente h in neuroni dopaminergici della substantia nigra pars compacta

1. Introduzione I neuroni dopaminergici (DA) della substantia nigra pars compacta (SNc) sono tra i più studiati nel sistema nervoso centrale per la loro implicazione nella malattia del Parkinson. Essi presentano un ampio corredo di correnti voltaggio-dipendenti, tra le quali emerge una tipica corrente attivata da iperpolarizzazione, la Ih. Diversamente dalla maggior parte delle cellule nervose, i neuroni dopaminergici della SNc presentano una attività spontanea regolare dopo isolamento o riduzione degli input sinaptici, e non è, quindi, sorprendente che numerosi lavori abbiano indagato il ruolo della Ih nell'attività spontanea. Tuttavia il ruolo della Ih non è stato ancora ben compreso, dal momento che il blocco di questa corrente non sembra comportare nessuna alterazione significativa della frequenza di scarica. Abbiamo, allora, riesaminato il problema studiando la corrente h, in fette sottili di cervello, in condizioni sperimentali che si differenziano dalla maggior parte degli studi precedenti per tre aspetti fondamentali: i) abbiamo utilizzato topi transgenici che esprimono una proteina reporter (GFP) sotto il promotore tirosina idrossilasi (TH), per identificare i neuroni DA della SNc; ii) abbiamo effettuato le registrazioni elettrofisiologiche a 37°C; iii) abbiamo eseguito la maggior parte degli esperimenti in condizioni di patch perforato al fine di lasciare inalterato l’ambiente fisiologico intracellulare. 2. Risultati Il nostro primo obiettivo è stato quello di effettuare un'analisi dettagliata della dipendenza della cinetica e dell’ampiezza della Ih dalla temperatura. Il protocollo di attivazione della corrente h prevedeva una serie di comandi iperpolarizzanti della durata di 4s e le registrazioni erano effettuate a 27°C e 37°C. Abbiamo calcolato che il coefficiente di temperatura (Q10) per la variazione di ampiezza della corrente h è pari 3,73, mentre i valori di Q10 relativi alle velocità di attivazione e deattivazione sono rispettivamente pari a 10,8 e 3,17. Il V50 è di -94,9 ± 1,07 mV a 27°C (n = 13) e -84,2 ± 1,31 mV a 37°C (n = 18). Abbiamo, successivamente, esaminato la modulazione da parte dei nucleotidi ciclici in condizioni di patch perforato a 37°C, in presenza di forskolina (10 μM), un attivatore della adenilato ciclasi, e IBMX (0.1 mM), un inibitore delle fosfodiesterasi, i quali, insieme, inducono un aumento della concentrazione intracellulare di adenosina monofosfato ciclico (cAMP). In queste condizioni abbiamo registrato un aumento dell'ampiezza Ih (da -178,53 ± 23,48 pA in condizioni di controllo a -227,01 ± 34,17 pA con forskolina a -130 mV, n = 8), uno spostamento del V50 di + 4,80 ± 0,68 mV (n = 8) e una riduzione delle costanti di tempo di attivazione di circa il 25%. Dato che questa modulazione è il risultato di un’interazione diretta del cAMP con il canale, abbiamo studiato gli effetti sulla Ih di diversi neurotrasmettitori accoppiati a proteine Gi o Gs, in particolare abbiamo testato la dopamina, la serotonina (5-HT) e la noradrenalina (NA). Il quinpirolo, un agonista dei recettori dopaminergici D2 (30 μM, dopo 3 minuti di applicazione nel bagno), ha indotto una diminuzione dell'ampiezza della Ih del 15% a -130 mV (n = 6), mentre il sulpiride, un antagonista dei recettori dopaminergici D2 (20 μM), ne ha determinato un aumento (n = 5). L'effetto sulla Ih della 5HT (100 μM), dopo 3 minuti di applicazione nel bagno, è stato una riduzione dell’ampiezza del 20% (n = 5); al contrario, l'applicazione nel bagno della NA (100 μM), ne ha indotto un aumento di circa il 12% (n = 8). Infine, abbiamo analizzato il ruolo della corrente h sull’autoritmicità. L'ivabradina (10 μM), bloccante del Ih, ha determinato una marcata iperpolarizzazione (circa -10 mV), che di fatto ha silenziato le cellule; tuttavia, questo effetto sull’attività spontanea era indiretto, poiché se la membrana era ripolarizzata, l’autoritmicità si ripristinava. 3. Conclusioni Gli studi eseguiti a temperatura ambiente sul ruolo e le proprietà della corrente h nei neuroni dopaminergici della SNc sono scarsamente informativi perché, in queste condizioni sperimentali, la corrente è sottovalutato in ampiezza, velocità e, in ultima analisi, nella sua capacità di svolgere alcun ruolo a potenziali fisiologici. Le registrazioni elettrofisiologiche a 37°C, invece, restituiscono un profilo più accurato e veritiero della Ih. La modulazione della corrente h ad opera di sistemi a secondo messaggero, un processo scarsamente esplorato nei neuroni dopaminergici della SNc, sembra essere rilevante, e suggerisce l'esistenza di diversi pathways importanti per il controllo dell’eccitabilità neuronale. La corrente h è, in ultima analisi, molto importante nell’autorimicità perché stabilizza il potenziale di membrana di riposo dei neuroni dopaminergici della SNc in uno stato depolarizzato, ma non ricopre un ruolo di principale nell’attività pacemaker. Questi risultati sono interessanti perché aprono nuove prospettive sul ruolo del canale HCN nei neuroni dopaminergici della substantia nigra pars compacta.