Le cellule ciliate nel labirinto della rana formano giunzioni citoneurali con le terminazioni nervose delle fibre afferenti dell'VIII nervo; esperimenti elettrofisiologici e tecniche di microscopia elettronica hanno dimostrato che la trasmissione a livello di queste sinapsi é di tipo chimico. Le fibre afferenti, che hanno un diametro compreso tra 1 e 10 microm, perdono la guaina mielinica quando attraversano la membrana basale dell'epitelio sensoriale ed ognuna di esse da origine a numerose terminazioni nervose che si pongono in contatto sinaptico con diverse cellule sensoriali. Questa disposizione anatomica fa si che i potenziali generatori postsinaptici che originano nelle diverse terminazioni di ogni fibra possano sommarsi aumentando la probabilità di insorgenza dei potenziali d'azione nella porzione elettricamente eccitabile dei singoli assoni. Le caratteristiche della scarica afferente dei recettori vestibolari, derivata sia in condizioni di riposo che di stimolazione rotazionale, sono state studiate in modo esteso nei pesci, nella rana e nei mammiferi. Nelle giunzioni citoneurali del sacculo del pesce rosso Furukawa et al, hanno potuto derivare sia in condizioni di riposo che di stimolazione potenziali postsinaptici dalle terminazioni nervose delle fibre afferenti. Inoltre essi hanno potuto dimostrare che la liberazione di mediatore chimico dalle cellule cigliate avviene in maniera quantale. Risultati simili sono stati ottenuti. da Flock et al, negli organi della linea laterale dei teleostei. Per quanto riguarda il labirinto della rana, Valli et al. e Taglietti et al. hanno registrato extracellularmente dalle fibre del nervo ampollare del canale posteriore un potenziale lento evocato dalla stimolazione dei recettori ampollari ed hanno interpretato questo segnale come la somma dei singoli potenziali generatori postsinaptici che si originano nelle terminazioni nervose di tutte le fibre afferenti di questo nervo. Tuttavia i processi elementari della trasmissione sinaptica nei recettori labirintici della rana non sono stati completamente chiariti per la difficoltà di ottenere derivazioni endocellulari dagli elementi pre- e postsinaptico. Lo scopo di questo lavoro é una analisi approfondita delle modalità della trasmissione sinaptica nell'epitelio sensoriale dei canali semicircolari attuata registrando endocellularmente da singoli assoni, in prossimità delle giunzioni citoneurali, la scarica afferente sia in condizioni di riposo che di stimolazione rotazionale. A questo scopo il labirinto membranoso della rana veniva evidenziato nell'emitesta destra, isolata dal corpo dell'animale, e posto in una adatta celletta ripiena di liquido di Ringer al centro di una tavola rotante in modo che il canale posteriore si trovasse nel piano di rotazione della piastra. Le derivazioni erano ottenute da singole fibre del nervo ampollare di questo canale impiegando microelettrodi di vetro ad elevata impedenza (30 - 40 MΩ) sostenuti da un micromanipolatore fissato al piano della piastra rotante. La stimolazione rotatoria era ottenuta impiegando variazioni di velocità angolare (10-110 gradi/sec) di tipo sinusoidale alla piastra rotante con una frequenza di 0,1 Hz. In tutte le fibre correttamente impalate é stato possibile mettere in evidenza in condizioni di riposo, accanto a potenziali d'azione d'ampiezza compresa tra i 60 e gli 80 mV, potenziali sottoliminari aventi una elevata frequenza (100-300/sec). Ogni potenziale sottosoglia presentava un fronte di salita piuttosto ripido ed un decadimento pressoché esponenziale, aveva una durata di 3-6 msec ed una ampiezza compresa tra gli 0,5 ed i 10 mV. Nelle diverse unità la frequenza dei potenziali d'azione spontanei (0-40/sec) era correlata positivamente con la frequenza dei potenziali sottoliminari. Nelle unità che presentavano una elevata scarica a riposo, la frequenza dei potenziali d’azione era modulabile durante tutto il ciclo di stimolazione rotazionale nel senso che aumentava durante la fase di accelerazione e diminuiva durante quella di decelerazione. Al contrario, le unità spontaneamente poco attive o silenti rispondevano con una scarica di impulsi solamente durante la fase di accelerazione. La frequenza dei potenziali sottoliminari era tale da dare già in condizioni di riposo una notevole sommazione; durante l’accelerazione questa sommazione diveniva così elevata da dare origine ad uno slivellamento della linea di base del tracciato, mentre durante la decelerazione la frequenza dei potenziali sottoliminari poteva essere ridotta fino alla completa scomparsa. I potenziali sottoliminari da noi registrati nelle fibre afferenti ampollari erano molto simili agli EPSPs descritti da Furukawa nel sacculo del pesce rosso. Tuttavia essi differivano mEPPs della placca motrice e dagli EPSPs delle sinapsi gangliari per l’elevata frequenza, per la maggior ampiezza e per la minor durata. Le anomalie dei potenziali sottoliminari da noi osservati rispetto ai classici mEPPs e mEPSPs descritti nelle altre sinapsi ci hanno indotto ad accertare con maggior sicurezza la loro natura postsinaptica. Anzitutto è stata studiata l’influenza della diminuzione del Ca2+ e dell’aumento del Mg2+ nel liquido di Ringer. Mantenendo normale a 1.8 mM la concentrazione del Ca2+ ed aumentando quella del Mg2+ a 10 mM, i potenziali d’azione erano completamente aboliti, mentre i potenziali sottosoglia diminuivano solamente in frequenza. In una soluzione contenente 10 mM di Mg2+ e 0.9 mM di Ca2+, si osservava una drastica riduzione sia della frequenza che dell’ampiezza dei potenziali sottoliminari che infine erano completamente aboliti quando in presenza di 10 mM di Mg2+ la concentrazione del Ca2+ era abbassata a 0.1 mM. La dipendenza dal Ca2+ e dal Mg2+ dei potenziali sottosoglia non si è ritenuta una prova assolutamente convincente della loro natura non rigenerativa. Per questo si è studiata anche l’azione della tetrodotossina (TTX) aggiunta al bagno ed inoltre anche perfusa per via arteriosa nell'intero animale prima di allestire il preparato al fine di consentire alla sostanza di superare le possibili barriere alla diffusione offerte dalle guaine connettivali del nervo e della parete del canale. In entrambe le condizioni sperimentali i potenziali d'azione venivano completamente soppressi dalla TTX in concentrazione 10-7-10-6g/ml, mentre i potenziali sottoliminari erano normalmente presenti e modulabili dallo stimolo rotazionale in modo del tutto simile a quello osservato nei preparati di controllo. Date le condizioni relativamente critiche che contraddistinguono l'impalamento di singole fibre mieliniche si é anche voluta escludere ogni possibilità di interferenza dovuta al campo elettrico generato dai potenziali d'azione presenti nelle fibre adiacenti a quella impalata. A questo scopo il nervo del canale posteriore da cui erano ottenute le derivazioni era staccato dal tronco dell'VIII nervo e stimolato mediante un elettrodo fluido. La stimolazione a 10/sec evocava nelle unità impalate potenziali antidromici simili in forma e decorso temporale agli ortodromici tuttavia essi si distinguevano facilmente da questi ultimi oltre che per essere preceduti dall'artefatto dello stimolo per il fatto che non presentavano alcun prepotenziale che esprimesse un evento sinaptico. Non é stato difficile realizzare una condizione in cui l'intensità dello stimolo fosse sufficiente per attivare antidromicamente la maggior parte delle fibre del nervo ampollare pur restando sottoliminare per la fibra dalla quale avveniva la derivazione. Anche in questa condizione che per l'attivazione sincronizzata di quasi tutte le fibre circostanti a quella impalata doveva ritenersi particolarmente favorevole ad una interferenza per effetto di campo non era possibile derivare dall'unità non stimolata alcun segnale riferibile all'attivazione delle fibre vicine. Queste prove dimostrano che i potenziali sottosoglia sono EPSPs che si generano alle giunzioni cito-neurali e si possono derivare elettrotonicamente da un considerevole tratto delle fibre afferenti. Riguardo alle differenze degli EPSPs ampollari rispetto a quelli messi in evidenza a livello di altre giunzioni sinaptíche si possono fare alcune considerazioni. L 'elevata frequenza degli EPSPs vestibolari é certamente da ricondurre alla convergenza dell'output sinaptico di diverse cellule sensoriali sulle terminazioni di ogni fibra afferente. E' noto d'altro canto che le fibre di minor diametro si congiungono sinapticamente con un maggior numero di cellule sensoriali rispetto alle fibre di diametro maggiore . Questa diversa disposizione anatomica può essere posta in relazione con la diversa frequenza di scarica delle varie unità sensoriali dei canali semicircolari. Infatti é probabile che le unità che presentano una più elevata frequenza spontanea di EPSPs e conseguentemente di potenziali propagati siano rappresentate dalle fibre di. minor diametro, mentre, le unità spontaneamente poco attive siano caratterizzate da fibre di diametro maggiore. La maggior ampiezza degli EPSPs derivati dagli assoni ampollari rispetto a quella delle giunzioni neuro- muscolari e probabilmente da ricondurre alla elevata impedenza elettrica dell'elemento postsinaptico costituito da terminazioni afferenti di piccole dimensioni. Inoltre la possibilità di derivare questi potenziali anche ad una discreta distanza dalle giunzioni cito-neurali dove si generano (500-600 microm) é probabilmente dovuta alle proprietà di cavo delle fibre afferenti che, data la loro natura mielinica, garantiscono una estesa diffusione elettrotonica delle correnti postsinaptiche. La completa dipendenza degli EPSPs vestibolari dalle concentrazioni in Ca2+ e Mg2+ presenti nel liquido di Ringer ed il fatto che possano venir completamente soppressi da appropriate deflessioni cupolari indica che essi non si generano per liberazione spontanea di mediatore chimico; non sono in altre parole assimilabili ai potenziali in miniatura della placca motrice. La liberazione del mediatore nelle giunzioni della cresta ampollare appare perciò di natura evocata anche in assenza di stimolazione. Questo fatto e in accordo con l'ipotesi di Davis secondo la quale la liberazione di mediatore dal polo sinaptico delle cellule cigliate é sostenuta anche in condizioni di riposo da una corrente stazionaria che fluisce attraverso queste cellule. I nostri risultati hanno dimostrato che nelle giunzioni citoneurali dei canali semicircolari un considerevole grado di sommazione degli EPSPs é sempre richiesto per portare alla soglia sia le unità ad elevata che quelle a bassa frequenza di scarica. La maggior o minor sommazione di un numero sempre elevato di potenziali sottoliminari nelle unità recettrici dei canali semicircolari probabilmente rende possibile una fine modulazione della scarica afferente e conseguentemente un elevato grado di fedeltà nella codificazione dell'informazione sensoriale.
DERIVAZIONE ENDOCELLULARE DELLA SCARICA AFFERENTE DEI RECETTORI AMPOLLARI NEL LABIRINTO ISOLATO DELLA RANA
ROSSI, Marialisa;
1977
Abstract
Le cellule ciliate nel labirinto della rana formano giunzioni citoneurali con le terminazioni nervose delle fibre afferenti dell'VIII nervo; esperimenti elettrofisiologici e tecniche di microscopia elettronica hanno dimostrato che la trasmissione a livello di queste sinapsi é di tipo chimico. Le fibre afferenti, che hanno un diametro compreso tra 1 e 10 microm, perdono la guaina mielinica quando attraversano la membrana basale dell'epitelio sensoriale ed ognuna di esse da origine a numerose terminazioni nervose che si pongono in contatto sinaptico con diverse cellule sensoriali. Questa disposizione anatomica fa si che i potenziali generatori postsinaptici che originano nelle diverse terminazioni di ogni fibra possano sommarsi aumentando la probabilità di insorgenza dei potenziali d'azione nella porzione elettricamente eccitabile dei singoli assoni. Le caratteristiche della scarica afferente dei recettori vestibolari, derivata sia in condizioni di riposo che di stimolazione rotazionale, sono state studiate in modo esteso nei pesci, nella rana e nei mammiferi. Nelle giunzioni citoneurali del sacculo del pesce rosso Furukawa et al, hanno potuto derivare sia in condizioni di riposo che di stimolazione potenziali postsinaptici dalle terminazioni nervose delle fibre afferenti. Inoltre essi hanno potuto dimostrare che la liberazione di mediatore chimico dalle cellule cigliate avviene in maniera quantale. Risultati simili sono stati ottenuti. da Flock et al, negli organi della linea laterale dei teleostei. Per quanto riguarda il labirinto della rana, Valli et al. e Taglietti et al. hanno registrato extracellularmente dalle fibre del nervo ampollare del canale posteriore un potenziale lento evocato dalla stimolazione dei recettori ampollari ed hanno interpretato questo segnale come la somma dei singoli potenziali generatori postsinaptici che si originano nelle terminazioni nervose di tutte le fibre afferenti di questo nervo. Tuttavia i processi elementari della trasmissione sinaptica nei recettori labirintici della rana non sono stati completamente chiariti per la difficoltà di ottenere derivazioni endocellulari dagli elementi pre- e postsinaptico. Lo scopo di questo lavoro é una analisi approfondita delle modalità della trasmissione sinaptica nell'epitelio sensoriale dei canali semicircolari attuata registrando endocellularmente da singoli assoni, in prossimità delle giunzioni citoneurali, la scarica afferente sia in condizioni di riposo che di stimolazione rotazionale. A questo scopo il labirinto membranoso della rana veniva evidenziato nell'emitesta destra, isolata dal corpo dell'animale, e posto in una adatta celletta ripiena di liquido di Ringer al centro di una tavola rotante in modo che il canale posteriore si trovasse nel piano di rotazione della piastra. Le derivazioni erano ottenute da singole fibre del nervo ampollare di questo canale impiegando microelettrodi di vetro ad elevata impedenza (30 - 40 MΩ) sostenuti da un micromanipolatore fissato al piano della piastra rotante. La stimolazione rotatoria era ottenuta impiegando variazioni di velocità angolare (10-110 gradi/sec) di tipo sinusoidale alla piastra rotante con una frequenza di 0,1 Hz. In tutte le fibre correttamente impalate é stato possibile mettere in evidenza in condizioni di riposo, accanto a potenziali d'azione d'ampiezza compresa tra i 60 e gli 80 mV, potenziali sottoliminari aventi una elevata frequenza (100-300/sec). Ogni potenziale sottosoglia presentava un fronte di salita piuttosto ripido ed un decadimento pressoché esponenziale, aveva una durata di 3-6 msec ed una ampiezza compresa tra gli 0,5 ed i 10 mV. Nelle diverse unità la frequenza dei potenziali d'azione spontanei (0-40/sec) era correlata positivamente con la frequenza dei potenziali sottoliminari. Nelle unità che presentavano una elevata scarica a riposo, la frequenza dei potenziali d’azione era modulabile durante tutto il ciclo di stimolazione rotazionale nel senso che aumentava durante la fase di accelerazione e diminuiva durante quella di decelerazione. Al contrario, le unità spontaneamente poco attive o silenti rispondevano con una scarica di impulsi solamente durante la fase di accelerazione. La frequenza dei potenziali sottoliminari era tale da dare già in condizioni di riposo una notevole sommazione; durante l’accelerazione questa sommazione diveniva così elevata da dare origine ad uno slivellamento della linea di base del tracciato, mentre durante la decelerazione la frequenza dei potenziali sottoliminari poteva essere ridotta fino alla completa scomparsa. I potenziali sottoliminari da noi registrati nelle fibre afferenti ampollari erano molto simili agli EPSPs descritti da Furukawa nel sacculo del pesce rosso. Tuttavia essi differivano mEPPs della placca motrice e dagli EPSPs delle sinapsi gangliari per l’elevata frequenza, per la maggior ampiezza e per la minor durata. Le anomalie dei potenziali sottoliminari da noi osservati rispetto ai classici mEPPs e mEPSPs descritti nelle altre sinapsi ci hanno indotto ad accertare con maggior sicurezza la loro natura postsinaptica. Anzitutto è stata studiata l’influenza della diminuzione del Ca2+ e dell’aumento del Mg2+ nel liquido di Ringer. Mantenendo normale a 1.8 mM la concentrazione del Ca2+ ed aumentando quella del Mg2+ a 10 mM, i potenziali d’azione erano completamente aboliti, mentre i potenziali sottosoglia diminuivano solamente in frequenza. In una soluzione contenente 10 mM di Mg2+ e 0.9 mM di Ca2+, si osservava una drastica riduzione sia della frequenza che dell’ampiezza dei potenziali sottoliminari che infine erano completamente aboliti quando in presenza di 10 mM di Mg2+ la concentrazione del Ca2+ era abbassata a 0.1 mM. La dipendenza dal Ca2+ e dal Mg2+ dei potenziali sottosoglia non si è ritenuta una prova assolutamente convincente della loro natura non rigenerativa. Per questo si è studiata anche l’azione della tetrodotossina (TTX) aggiunta al bagno ed inoltre anche perfusa per via arteriosa nell'intero animale prima di allestire il preparato al fine di consentire alla sostanza di superare le possibili barriere alla diffusione offerte dalle guaine connettivali del nervo e della parete del canale. In entrambe le condizioni sperimentali i potenziali d'azione venivano completamente soppressi dalla TTX in concentrazione 10-7-10-6g/ml, mentre i potenziali sottoliminari erano normalmente presenti e modulabili dallo stimolo rotazionale in modo del tutto simile a quello osservato nei preparati di controllo. Date le condizioni relativamente critiche che contraddistinguono l'impalamento di singole fibre mieliniche si é anche voluta escludere ogni possibilità di interferenza dovuta al campo elettrico generato dai potenziali d'azione presenti nelle fibre adiacenti a quella impalata. A questo scopo il nervo del canale posteriore da cui erano ottenute le derivazioni era staccato dal tronco dell'VIII nervo e stimolato mediante un elettrodo fluido. La stimolazione a 10/sec evocava nelle unità impalate potenziali antidromici simili in forma e decorso temporale agli ortodromici tuttavia essi si distinguevano facilmente da questi ultimi oltre che per essere preceduti dall'artefatto dello stimolo per il fatto che non presentavano alcun prepotenziale che esprimesse un evento sinaptico. Non é stato difficile realizzare una condizione in cui l'intensità dello stimolo fosse sufficiente per attivare antidromicamente la maggior parte delle fibre del nervo ampollare pur restando sottoliminare per la fibra dalla quale avveniva la derivazione. Anche in questa condizione che per l'attivazione sincronizzata di quasi tutte le fibre circostanti a quella impalata doveva ritenersi particolarmente favorevole ad una interferenza per effetto di campo non era possibile derivare dall'unità non stimolata alcun segnale riferibile all'attivazione delle fibre vicine. Queste prove dimostrano che i potenziali sottosoglia sono EPSPs che si generano alle giunzioni cito-neurali e si possono derivare elettrotonicamente da un considerevole tratto delle fibre afferenti. Riguardo alle differenze degli EPSPs ampollari rispetto a quelli messi in evidenza a livello di altre giunzioni sinaptíche si possono fare alcune considerazioni. L 'elevata frequenza degli EPSPs vestibolari é certamente da ricondurre alla convergenza dell'output sinaptico di diverse cellule sensoriali sulle terminazioni di ogni fibra afferente. E' noto d'altro canto che le fibre di minor diametro si congiungono sinapticamente con un maggior numero di cellule sensoriali rispetto alle fibre di diametro maggiore . Questa diversa disposizione anatomica può essere posta in relazione con la diversa frequenza di scarica delle varie unità sensoriali dei canali semicircolari. Infatti é probabile che le unità che presentano una più elevata frequenza spontanea di EPSPs e conseguentemente di potenziali propagati siano rappresentate dalle fibre di. minor diametro, mentre, le unità spontaneamente poco attive siano caratterizzate da fibre di diametro maggiore. La maggior ampiezza degli EPSPs derivati dagli assoni ampollari rispetto a quella delle giunzioni neuro- muscolari e probabilmente da ricondurre alla elevata impedenza elettrica dell'elemento postsinaptico costituito da terminazioni afferenti di piccole dimensioni. Inoltre la possibilità di derivare questi potenziali anche ad una discreta distanza dalle giunzioni cito-neurali dove si generano (500-600 microm) é probabilmente dovuta alle proprietà di cavo delle fibre afferenti che, data la loro natura mielinica, garantiscono una estesa diffusione elettrotonica delle correnti postsinaptiche. La completa dipendenza degli EPSPs vestibolari dalle concentrazioni in Ca2+ e Mg2+ presenti nel liquido di Ringer ed il fatto che possano venir completamente soppressi da appropriate deflessioni cupolari indica che essi non si generano per liberazione spontanea di mediatore chimico; non sono in altre parole assimilabili ai potenziali in miniatura della placca motrice. La liberazione del mediatore nelle giunzioni della cresta ampollare appare perciò di natura evocata anche in assenza di stimolazione. Questo fatto e in accordo con l'ipotesi di Davis secondo la quale la liberazione di mediatore dal polo sinaptico delle cellule cigliate é sostenuta anche in condizioni di riposo da una corrente stazionaria che fluisce attraverso queste cellule. I nostri risultati hanno dimostrato che nelle giunzioni citoneurali dei canali semicircolari un considerevole grado di sommazione degli EPSPs é sempre richiesto per portare alla soglia sia le unità ad elevata che quelle a bassa frequenza di scarica. La maggior o minor sommazione di un numero sempre elevato di potenziali sottoliminari nelle unità recettrici dei canali semicircolari probabilmente rende possibile una fine modulazione della scarica afferente e conseguentemente un elevato grado di fedeltà nella codificazione dell'informazione sensoriale.I documenti in SFERA sono protetti da copyright e tutti i diritti sono riservati, salvo diversa indicazione.
